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65746
Phospho-RIP (Ser166) (D1L3S) Rabbit mAb
一抗
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R
重组

Phospho-RIP (Ser166) (D1L3S) Rabbit mAb #65746

引用 (149)
筛选器：
  1. WB
对未经处理 (-) 或已经以下联合处理方法处理（如图）的 HT-29 细胞进行蛋白质印迹分析：Z-VAD（20 μM，先于其他混合物 30 分钟添加；+）、人 TNF-α（hTNF-α，20 ng/ml，7 小时；+）、SM-164（100 nM，7 小时；+）和 necrostatin-1（Nec-1，50 μM，7 小时；+），使用 Phospho-RIP (Ser166) (D1L3S) Rabbit mAb（上图）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）。
使用 Phospho-RIP (Ser166) (D1L3S) Rabbit mAb #65746 对经过 ZVAD（20uM，7.5 小时）+ hTNF-α（20ng/mL，7 小时）+ SM-164（100nM，7 小时）处理的 HT-29 细胞的裂解物 (0.1 mg/mL) 进行 Simple Western™ 分析。虚拟泳道式图像（左图）显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的靶标条带（如图所示）。对应的电泳图（右图）为一抗稀释比例在 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）时沿毛细血管内分子量的化学发光结果。在还原条件下，使用 12-230 kDa 分离模块在 ProteinSimple（BioTechne 品牌）的 Jess™ Simple Western 仪器上进行该实验。
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65746S		 100 µl

Carrier-Free Bulk & Custom Formulation

支持性数据

反应性 H
灵敏度 内源性
MW (kDa) 78-82
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
Simple Western™ 1:10 - 1:50

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹，在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜，同时柔和振摇。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测，进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O，混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ，混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ，混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

特异性/灵敏度

Phospho-RIP (Ser166) (D1L3S) Rabbit mAb 仅在 RIP 蛋白在 Ser166 位点被磷酸化时方可识别内源水平的 RIP 蛋白。

物种反应性：

人

来源/纯化

使用与人 RIP 蛋白中 Ser166 周围残基相对应的合成磷酸肽，对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

丝氨酸-苏氨酸激酶的受体互作蛋白 (RIP) 家族（RIP、RIP2、RIP3 和 RIP4）是重要的细胞应激调节分子，可通过 NF-κB 激活和促凋亡通路诱导促活和炎症反应 (1)。除激酶结构域外，RIP 还包含一个负责与死亡结构域受体 Fas 相互作用并通过与 TRADD 相互作用募集到 TNF-R1 的死亡结构域 (2,3)。RIP 缺失的细胞无法激活 TNF 介导的 NF-κB，从而使细胞对凋亡更为敏感 (4,5)。RIP 还与 TNF 受体相关因子 (TRAF) 相互作用，并且可通过与 NEMO 相互作用募集 IKK 到 TNF-R1 信号转导复合体，从而导致 IκB 磷酸化和降解 (6,7)。RIP 过表达会诱导 NF-κB 激活和凋亡 (2,3)。RIP 死亡结构域的 caspase-8 依赖性剪切会诱导 RIP 的凋亡活性 (8)。
坏死性凋亡，一个坏死性细胞死亡的调节通路，由多个炎症信号触发，包括肿瘤坏死因子 (TNF) 家族中的细胞因子、toll 样受体 (TLR) 等病原体传感物和缺血性损伤 (9,10)。这个过程由 caspase 负调控，并由含有 RIP 和 RIP3 激酶的复合体（通常称为坏死体）启动。RIP 的小分子抑制因子 necrostatin-1 (Nec-1) 会抑制坏死性凋亡 (11)。研究表明，坏死性凋亡会导致许多病理情况，并且 Nec-1 经证明可在缺血性脑损伤等模型中提供神经保护 (12)。RIP 在激酶结构域中对 Nec-1 敏感的多个位点被磷酸化，这些位点包括 Ser14、Ser15、Ser161 和 Ser166 (13)。

通路

探索与本品相关的通路。

有限使用

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