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93654
Phospho-RIP3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb
一抗
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R
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Phospho-RIP3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb #93654

引用 (79)
筛选器：
  1. WB
  2. IF
对未经处理 (-) 或已经以下联合处理方法处理的 HT-29 细胞进行蛋白质印迹分析：Z-VAD（20 μM，先于其他化合物 30 分钟添加；+）、Human Tumor Necrosis Factor-α #8902（hTNF-α，20 ng/ml，7 小时；+）和 SM-164（100 nM，7 小时；+），使用 Phospho-RIP3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb。膜不用（左图）或用牛小肠磷酸酶处理（CIP；右图），以确定磷酸特异性。
对未经处理 (-) 或已经以下联合处理方法处理的 HT-29 细胞进行蛋白质印迹分析：Z-VAD（20 μM，先于其他混合物 30 分钟添加；+）、人 Tumor Necrosis Factor-α #8902（hTNF-α, 20 ng/ml，7 小时；+）、SM-164（100 nM，7 小时；+）和 necrostatin-1（Nec-1，50 μM, 7小时；+），使用 Phospho-RIP3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb（上图），RIP3 (E1Z1D) Rabbit mAb #13526（中图）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）。
对未经处理 (-) 或已经以下联合处理方法处理的 HT-29 细胞或 HT-29 RIPK1 KO 细胞进行蛋白质印迹分析：Z-VAD（20 μM，先于其他混合物 30 分钟添加；+）、人 Tumor Necrosis Factor-α #8902（hTNF-α，20 ng/ml, 7 小时；+）和 SM-164（100 nM，7 小时；+）使用 Phospho-RIP3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb（上图），RIP3 (E1Z1D) Rabbit mAb #13526（中图）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）。HT-29 RIPK1 KO 细胞由马萨诸塞州波士顿哈佛大学医学院的 Junying Yuan 博士惠赠。
使用 Phospho-RIPK3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb（绿色）对未处理的（左图）、经 Z-VAD（20 μM，30 分钟）预处理后再经 SM-164 (100 nM) 和 Human Tumor Necrosis Factor-α (hTNF-α) #8902（20 ng/mL，6 小时；中间）处理，或经 Z-VAD 预处理后再经 SM-164 和 hTNF-α 处理，随后经 λ 磷酸酶后处理（右图）的 HT-29 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白微丝由 DyLight™ 554 Phalloidin #13054（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。
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Carrier-Free Bulk & Custom Formulation

支持性数据

反应性 H
灵敏度 内源性
MW (kDa) 46-62
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫荧光法（免疫细胞化学） 1:800 - 1:3200

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹，在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜，同时柔和振摇。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测，进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O，混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ，混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ，混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

若想获得高质量的免疫荧光图片，请使用我们 #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit 中高效且划算的预制试剂。

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如 Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (9998)，并混合。

  5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗：

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意：甲醛有毒性，需在通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

发布​时间 2006 年 11 月

修订时间 2013 年 11 月

实验步骤编号：24

特异性/灵敏度

Phospho-RIP3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb 仅在 RIP3 蛋白在 Ser227 位点被磷酸化时方可识别内源水平的 RIP3 蛋白。还检测到一个似乎是 RIP3 裂解产物的 30 kDa 条带。

物种反应性：

人

来源/纯化

使用与人 RIP3 蛋白中 Ser227 周围残基相对应的合成磷酸肽，对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

丝氨酸-苏氨酸激酶的受体互作蛋白 (RIP) 家族（RIP、RIP2、RIP3 和 RIP4）是重要的细胞应激调节分子，可通过 NF-κB 激活和促凋亡通路诱导促活和炎症反应 (1)。除激酶结构域外，RIP 还包含一个负责与死亡结构域受体 Fas 相互作用并通过与 TRADD 相互作用募集到 TNF-R1 的死亡结构域 (2,3)。RIP 缺失的细胞无法激活 TNF 介导的 NF-κB，从而使细胞对凋亡更为敏感 (4,5)。RIP 还与 TNF 受体相关因子 (TRAF) 相互作用，并且可通过与 NEMO 相互作用募集 IKK 到 TNF-R1 信号转导复合体，从而导致 IκB 磷酸化和降解 (6,7)。RIP 过表达会诱导 NF-κB 激活和凋亡 (2,3)。RIP 死亡结构域的 caspase-8 依赖性剪切会诱导 RIP 的凋亡活性 (8)。
受体互作蛋白 3 (RIP3) 最初被发现会与 RIP 和 TNF 受体复合体相互作用，从而诱导细胞凋亡和 NF-κB 激活(9,10)。后续研究表明，RIP 和 RIP3 之间的结合是一个信号转导通路的关键组分，这种组分会导致程序性坏死（坏死性凋亡），这是一种在有 caspase 抑制因子的情况下由 TNF 诱导的坏死性细胞死亡 (11-13)。RIP3 在 Ser227 位点被磷酸化，并靶向类混合谱系激酶结构域蛋白 (MLKL) 的磷酸化，这对坏死性凋亡至关重要 (14)。在小鼠中，RIP3 在 Thr231 和 Ser232 位点被磷酸化，从而导致 MLKL 与坏死性凋亡有关 (15)。

通路

探索与本品相关的通路。

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