AFP (3H8) Mouse mAb (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #7877

免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
3. 通透缓冲液 (1X PBS/0.2% Triton X-100)：
   要配制 25 ml，添加 2.5 ml 10X PBS 到 22.5 ml dH₂O 中，混匀。搅拌时加入 50 µl Triton X-100。
4. Image-iT™ FX Signal Enhancer (#11932)
5. 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如 Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH₂O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
6. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (9998)，并混合。
7. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注： 细胞应在多孔板、室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。注意：甲醛有毒性，仅可在通风橱中使用
2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在通透缓冲液中室温通透处理细胞 5 分钟。
2. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
3. 滴 3-4 滴 Image-iT™ FX Signal Enhancer (#11932)，并在室温下孵育 30 分钟。
4. 用 1X PBS 清洗三次，每次 5 分钟。
5. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
6. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
7. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
8. 4°C 温度下孵育过夜。
9. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
10. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong^® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
11. 为达到最佳效果，应立即采用适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。