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5588
EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)
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R
重组

EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #5588

引用 (6)
筛选器：
  1. IF
  2. F
使用 EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)（伪彩灰色）和 DAPI #4083（蓝色）对血清饥饿（左图）然后经过 EGF（100 ng/mL，15 分钟）处理（右图）的 A549 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。
使用 EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)（实线）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #2985（虚线）对 K562 细胞（蓝色）和 FaDu 细胞（绿色）进行流式细胞分析。
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5588S		 100 µl （50 次检测）

Bulk & Custom Formulation

支持性数据

反应性 H M Mk
灵敏度 内源性
MW (kDa)
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品说明

这种 Cell Signaling Technology 抗体偶联于 Alexa Fluor® 647 荧光染料，并针对人细胞中直接流式细胞术和免疫荧光分析接受内部检测。该抗体的物种交叉反应性预计与非偶联 EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb #4267 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
免疫荧光法（免疫细胞化学） 1:400
流式细胞术（固定/通透） 1:50

保存

保存在 PBS（pH 为 7.2）、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。4°C 保存。切勿分装抗体。避光。切勿冷冻。

实验步骤

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免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton™ X-100)：要配制 10 ml：添加 0.5 ml normal goat serum 和 0.5 ml 20X PBS 到 9.0 ml dH2O 中，混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液： (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。
  5. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意：甲醛有毒性，需在通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
  7. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

发布​时间 2006 年 11 月

修订时间 2013 年 11 月

实验步骤编号：182

流式细胞术，针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买，或使用下文所列的货号单独购买。

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：若要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水，混合。
  2. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604)：用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活力指示染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品网页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定

注：固定前，贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

注：如果使用全血，则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

注：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白质的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。继续进行透化步骤。
    1. 或者，细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

  1. 通过温和涡旋混合的同时，向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度，使细胞透化。
  2. 在冰上透化最短 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色（D 部分）或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次测定 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。）
  2. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离，以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
  4. 室温孵育 1 小时。避光。
  5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2009 年 7 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：407

特异性/灵敏度

EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 可检测内源水平的 EGF 受体总蛋白。该抗体不与其他 ErbB 家族蛋白发生交叉反应。IF-IC 的物种交叉反应性仅限于人体内。

物种反应性：

人, 小鼠, 猴

来源/纯化

使用包含人 EGF 受体胞质域的融合蛋白，对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

表皮生长因子 (EGF) 受体是一种 HER/ErbB 蛋白家族的跨膜酪氨酸激酶。配体结合后，会导致受体二聚化、自磷酸化、下游信号转导激活、内化以及溶酶体降解 (1,2)。激酶结构域中 EGF 受体 (EGFR) 在 Tyr845 的磷酸化具有稳定激活环、维持酶激活状态以及为底物蛋白提供结合表面的作用 (3,4)。c-Src 与 EGFR 在 Tyr845 的磷酸化有关 (5)。PLCγ 的 SH2 结构域在磷酸化的 Tyr992 位点结合，从而激活 PLCγ 介导的下游信号转导 (6)。EGFR 在 Tyr1045 的磷酸化为接头蛋白 c-Cbl 提供了一个主要锚定位点，以便让 EGFR 在激活后进行受体泛素化和降解 (7,8) GRB2 接头蛋白在磷酸化-Tyr1068 位点与激活的 EGFR 相结合 (9)。一对磷酸化的 EGFR 残基（Tyr1148 和 Tyr1173）为 Shc 支架蛋白提供了一个锚定位点，两个位点都参与了 MAP 激酶信号转导的激活 (2)。EGFR 在特定丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸化会降低 EGFR激酶活性。EGFR 羧基末端残基 Ser1046 和 Ser1047 被 CaM 激酶 II 磷酸化，其中任何一个丝氨酸突变都会导致 EGFR 酪氨酸自磷酸化上调 (10)。

通路

探索与本品相关的通路。

有限使用

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