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40683
TrueBlack® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit
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TrueBlack® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit #40683

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使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060（上图）、Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691（中图）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图），对未经处理 (-) 或经 LY294002 #9901 或 Calyculin A #9902 (+) 处理的 Jurkat 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。用我们的标准抗体稀释剂和封闭缓冲液（左图）或用 TrueBlack® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit（右图）处理蛋白印迹膜。使用 TrueBlack® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit 时，可观察到抗体灵敏度增加，背景荧光减少。
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To Purchase # 40683S
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40683S		 1 个试剂盒（50 次蛋白印迹实验）

Custom Formulation

产品包括 数量
TrueBlack® WB Blocking Buffer 500 ml
TrueBlack® WB Antibody Diluent 1 升

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保存在 4ºC 下。少许沉淀物可能存在，但不会干扰产品性能。4ºC 保存时，该试剂盒的所有组分j均稳定 24 个月。建议使用前加温至室温并混合。

实验步骤

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蛋白印迹法实验步骤（荧光）

注：TrueBlack® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit (#40683) 含有为封闭印迹膜和稀释一抗和二抗所必需的缓冲液。

注：双色蛋白质印迹法需要不同物种的一抗和不同染料标记的二抗。表位重叠可能造成干扰，因而应当在双色蛋白质印迹法中加以考虑。如果一抗需要不同的一抗孵育缓冲液，则在两种缓冲液中分别对每种一抗进行检验，以确定最适合进行双重标记实验的缓冲液。

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O，混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 若要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ，混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O，混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 若要配制 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O ，混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 缓冲盐水：(#9997) 若要配制 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O，混合。
  7. 洗涤缓冲液：1X TBST。
  8. TrueBlack® WB Blocking Buffer： (#57443) 即用型溶液。
  9. TrueBlack® WB Antibody Diluent：(#78710) 即用型溶液。（二抗；抗兔 #5151 和 #5366；抗小鼠 #5257 和 #5470）。
  10. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
  11. 印迹用膜与纸：(#12369) 本实验步骤已经针对硝酸纤维素膜优化（推荐）。通常推荐 0.2 µm 孔径。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；使用冷的 1X PBS 洗涤细胞；吸取。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板每平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329, 10 µl/泳道）上样以验证电转移和确定分子量。预染标准品在近红外波长范围内具有自发荧光。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。

  2. 将 TrueBlack® WB Blocking Buffer 加温至室温，并在使用前充分混合。

    注：TrueBlack® WB Blocking Buffer 可能有少许沉淀物，但这不会影响性能。

  3. 将膜在 10 mL TrueBlack® WB Blocking Buffer 中室温孵育 45 分钟。
  4. 移除 TrueBlack® WB Blocking Buffer。
  5. 将膜和一抗（按产品说明书中建议的适宜稀释度）在 10 mL TrueBlack® WB Antibody Diluent 中 4°C孵育过夜，同时温和搅动。
  6. 用 15 mL TBST 洗涤五次，每次 10 分钟。
  7. 将膜与荧光素偶联的二抗（#5470、#5257、#5366、#5151）（1 mg/mL 原液 1:5000-1:25,000 稀释）在 10 mL TrueBlack® WB Antibody Diluent 中室温避光孵育 2 小时，温和搅动。
  8. 用 15 mL TBST 洗涤五次，每次 10 分钟，避光。

D. 蛋白质检测

  1. 将膜上多余的 TBST 沥干，可使其干燥。

    关键步骤：对于荧光染色，膜必须呈干燥状态。

  2. 请使用合适的荧光扫描仪并根据制造商的建议扫描膜。

实验步骤编号：2544

产品说明

TrueBlack® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit 经专门配制，以通过阻断荧光团标记的抗体和蛋白印迹膜之间非特异性相互作用，提高荧光蛋白印迹测定法的特异性和灵敏度。该试剂盒提供为阻断带电染料引起的非特异性蛋白结合与背景所需的试剂。该试剂盒的试剂适用于硝酸纤维素膜和聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜。该试剂盒不用于化学发光检测。

有限使用

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