7-AAD/CFSE Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Kit #72782

#72782 7-AAD/CFSE 细胞介导的细胞毒性检测试剂盒

A. 溶液与试剂

提供的试剂：

1. 基于细胞的测定缓冲液：将每个基于细胞的测定缓冲液片剂 (#27868) 溶解在 100 ml 的反渗透去离子 (RODI) 水中。充分混合以确保片剂溶解。稀释的缓冲液在室温下可稳定一年。
2. 7-AAD 活性染料：将 10 μl 7-AAD 活性染料（1,000X）（#89587）添加到 10 ml 基于细胞的检测缓冲液中，并充分混合。
3. CFSE 染色溶液：首先，通过向 10 ml的基于细胞的测定缓冲液中添加 10 mg BSA，制备 0.1% BSA/检测缓冲液。然后在 0.1％ BSA/检测缓冲液中以 1:500 的比例稀释 CFSE 储备溶液（#16650）并充分混合。每10 ⁷细胞需要 1 ml CFSE 染色溶液。

注意：推荐的实验步骤使用 CFSE 标记细胞，使其足够明亮以区分标记和未标记的细胞，但又模糊到不渗入其他通道。但是，如果需要更亮的染色，则可以从 CFSE 染色溶液制备中省略 BSA。

其他试剂（未提供）：

1. Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998)

B. 靶细胞标记

注意：正确分析数据，需要以下对照目标细胞组来设置流式细胞仪和补偿：

• 未染色靶细胞
• 针对每个标签或染色的单染靶细胞

1. 获取靶细胞用于细胞毒性检测。该检测的最佳条件和孵育时间应根据个别情况确定。
2. 以 400 x g 离心细胞五分钟。吸出上清液并轻拂试管以使沉淀物破裂。
3. 将细胞沉淀物以 10⁷ 细胞/ml 的浓度快速重悬于 CFSE 染色液（按溶液和试剂中所述制备）中。应当尽快达到均匀的悬浮液，因为几乎立即吸收 CFSE，并且 CFSE 浓度的局部变化会影响染色的均匀性。对照靶细胞（不含 CFSE 的靶细胞）应重悬在 0.1% BSA/检测缓冲液。
4. 将细胞在 CFSE 染色液中于 37°C 下孵育 15 分钟。
5. 加入至少 10 体积的含 FBS 的培养基。将靶细胞以 400 x g 离心五分钟。
6. 抽吸上清液。
7. 将靶细胞重悬于 10 ml培养基中。
8. 将靶细胞以 400 x g 离心五分钟。
9. 抽吸上清液。
10. 以 10⁵ 细胞/ml 的浓度将靶细胞重悬于培养基中。
11. 在 37°C 下将细胞在 CO₂ 培养箱中培养 30 分钟或更长时间（但时间不足以使细胞增殖）。

C. 检测流程

1. 将效应细胞收集到试管中。以 400 x g 离心细胞 五分钟以进行沉淀。
2. 以 510⁶ 细胞/ml 的浓度将细胞重悬于培养基中。
3. 以预定的效应器/靶细胞比率将效应细胞添加到 CFSE 标记的靶细胞悬浮液中。下表显示了一些示例：
   
   

   效应器:靶细胞比率	效应细胞悬浮液	靶细胞悬浮液	靶细胞培养基	最终体积
   0	0 ml	1.5 ml	0 ml	1.5 ml
   6.25:1	0.125 ml	1 ml	0.375 ml	1.5 ml
   12.5:1	0.25 ml	1 ml	0.25 ml	1.5 ml
   25:1	0.5 ml	1 ml	0 ml	1.5 ml

4. 根据您的最佳方案，将细胞混合物培养 4 小时或一段时间，以便有足够的时间进行细胞溶解活动。
5. 如本文所述，在96孔 v 底板中染色，将细胞移入板中，并在 400 x g下离心 5 分钟。（对于试管中的染色，将体积放大 5 倍）。
6. 抽吸上清液。

   注意：如果要检测其他表面标记，可以在实验步骤中于此时插入染色。

7. 将细胞重悬于 200 μl7-AAD 活性染料（按照“溶液和试剂”中所述进行制备）并充分混合。对照靶细胞（不含 CFSE 或 7-AAD 活性染料的靶细胞或仅具有 CFSE 染色的靶细胞）应重悬于200 μl 检测缓冲液中。
8. 在黑暗中于 4°C 下孵育细胞 15 分钟。
9. 现在可以使用流式细胞仪进行细胞分析了，应该立即进行分析。开启 CFSE+ 靶细胞（ex/em 488 / 525），然后通过 7-AAD 排除（ex/em 488 / 647）可视化活/死细胞百分比。

D. 疑难解答