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8821
Active Ras Detection Kit
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Active Ras Detection Kit #8821

引用 (0)
图 1. NIH/3T3 细胞裂解物（500 µl，1 mg/ml）在体外用 GTPγS 或 GDP 处理会使 Ras 激活或失活（参阅实验步骤中的可选步骤 C）。裂解物随后与谷胱甘肽树脂和 GST-Raf1-RBD（泳道 2 和 3）进行孵育。以谷胱甘肽树脂作为阴性对照（泳道 4），已经 GTPγS 处理的裂解物，在不含GST-Raf1-RBD的情况下，也进行孵育。使用 Ras mouse mAb 对细胞裂解物（20 µg，泳道 1）或 20 µl 洗脱样品（泳道 2、3 和 4）进行蛋白质印迹分析。Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076 用作二抗。
图 2. 如图所示，GTP 结合 GTP 酶沉淀过程可分为 3 个步骤。步骤 1：在旋转杯中混合样品、结合蛋白和谷胱甘肽树脂，并在 4ºC 下孵育，以使 GTP 结合的 GTP 酶通过 GST 连接的结合蛋白与谷胱甘肽树脂结合。步骤 2：通过离心分离去除未结合的蛋白。步骤 3：用 SDS 缓冲液洗脱结合谷胱甘肽树脂的 GTP 酶。洗脱样品随后通过蛋白质印迹实验进行分析。
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To Purchase # 8821S
目录# 规格 价格 库存
8821S		 1 个试剂盒（30 次免疫沉淀）

Custom Formulation

产品包括 数量（计数） 保存温度
GTP γS 1 x 50 µl -80°C
GDP 1 x 50 µl -80°C
Glutathione Resin 1 x 3 ml +4°C
Lysis/Binding/Wash Buffer 1 x 100 ml +4°C
SDS Sample Buffer 1 x 1.5 ml +4°C
Spin Cup and Collection Tubes 1 x 30 ea RT
GST-Raf1-RBD 1 x 2.4 mg -80°C
Ras Mouse mAb 1 x 250 µl +4°C

保存

GTPγS：储存于 -80°C 下
GDP：储存于 -80°C 下
GST-Raf1-RBD：储存于 -80°C 下
裂解/结合/洗涤缓冲液：储存于 4°C 下
谷胱甘肽树脂：储存于 4°C 下
SDS 样品缓冲液：储存于 4°C 下
旋转杯和收集管：在室温下储存
Ras Mouse mAb：储存于 4°C 下

产品说明

Active Ras Detection Kit 提供了检测细胞中Ras GTP 酶活化所必需的所有试剂。GST-Raf1-RBD 融合蛋白用于结合活化形式的 GTP 结合 Ras，GTP 结合 Ras 随后可用谷胱甘肽树脂进行免疫沉淀。随后使用 Ras mouse mAb 进行蛋白质印迹实验来确定 Ras 激活水平。

特异性/灵敏度

Active Ras Detection Kit 可检测内源水平的 GTP 结合（活化）Ras，如图 1 所示。经内部测试确定，该试剂盒可检测规定物种中的蛋白，但也可能检测其他物种的同源蛋白。

背景

小 GTP 结合蛋白（G 蛋白）Ras 超家族包含一大类蛋白（超过 150 个成员），根据它们的序列和功能相似性，可分为至少五个家族：Ras、Rho、Rab、Arf 和 Ran (1-3)。这些小 G 蛋白均有 GDP/GTP 结合及 GTP 酶活性，并在各种细胞和发育活动中作为双向转换器发挥作用，这些活动包括细胞周期进程、细胞存活、肌动蛋白细胞骨架组织、细胞极性和运动以及囊泡和胞核转运 (1)。上游信号会刺激 GDP 结合形式（失活）解离 GDP，导致 GTP 结合及 GTP 结合形式（活化）的形成。活化 G 蛋白随后在其下游效应子结合区域发生构象变化，从而结合并调节下游效应子。固有 GTP 酶活性会阻断这种激活，使 GTP 水解成 GDP 并释放下游效应子。Ras 超家族蛋白的这些固有鸟嘌呤核苷酸交换和 GTP 水解活性还受鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 的调控，GEF 会促进活化 GTP 结合形式和 GTP 酶激活蛋白 (GAP) 的形成，从而将 GTP 酶还原成失活的 GDP 结合形式 (4)。
21 kDa 的鸟嘌呤-核苷酸结合蛋白（K-Ras、H-Ras 和 N-Ras）在活化（GTP 结合）和失活（GDP 结合）形式之间循环 (5)。受体酪氨酸激酶和 G 蛋白偶联受体会激活 Ras，从而刺激 Raf-MEK-MAPK 通路 (6-8)。GAP 蛋白通常会促进 Ras 失活。但在 30% 的人肿瘤细胞中，Ras 的点突变可防止该通路发生 GAP 介导性抑制 (9)。肿瘤细胞中最常见的致癌性 Ras 突变是 Gly12 突变为 Asp (G12D)，这可能通过增加蛋白的整体刚性来防止 Ras 失活 (9,10)。

通路

探索与本品相关的通路。

有限使用

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