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LDH Cytotoxicity Assay Kit
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LDH Cytotoxicity Assay Kit #37291

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LDH 细胞毒性测定的最佳细胞数的确定：HeLa 细胞以不同的密度使用含有 10% FBS 的培养基接种到 96 孔板中。孵育过夜后，用无血清培养基替换细胞，然后用测定缓冲液（自发 LDH 释放）或 10% Triton™ X-100 溶液（最大 LDH 释放）处理。处理后，除去培养基并放入新的 96 孔板中。使用 LDH 细胞毒性测定试剂盒实验步骤确定释放到培养基中的 LDH 量。
Staurosporine 诱导的 LDH 释放的测定：HeLa 细胞以 10,000 个细胞/孔的密度接种在补充有 1% FBS 的培养基中，然后用溶剂对照或 1 μM Staurosporine #9953 处理 24 小时。使用 LDH 细胞毒性测定试剂盒实验步骤计算释放到培养基中的 LDH 和细胞毒性百分比。
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37291S		 1 个试剂盒（480 次检测）

Custom Formulation

产品包括 数量（计数）
Diaphorase 1 x 1 次
INT (100X) 1 x 500 µl
LDH Positive Control 1 x 1 次
Lactic Acid (100X) 1 x 500 µl
NAD+ (100X) 1 x 500 µl
Triton™ X-100 (10%) 1 x 10 ml
Cell-Based Assay Buffer Tablet 1 x 1 次

实验步骤

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LDH 细胞毒性测定试剂盒实验步骤

A. 溶液与试剂

提供的试剂
  1. 心肌黄酶 (#50173)：用 600ul RODI 水复溶。（使用过程中放在冰上。不使用时，储存于 -20°C 下。该溶液冻融仅可一次。如果您计划在多次实验中使用此溶液，我们建议您将其分装在 -20°C 下储存。）
  2. NAD⁺ (100X)：#95899
  3. 乳酸（100100X）：#23346
  4. INT (100X)：#34743
  5. LDH 阳性对照 (#67843)；可选：溶液中的 LDH 阳性对照对温度非常敏感。临用前，在 1.8 毫升冰冷的 RODI 水中复溶。请勿涡旋，轻轻混合。进行测定时，将复溶的 LDH 阳性对照放在冰上。分装并立即在 -80°C 下冷冻未使用的重组 LDH 阳性对照。冷冻的分装样本a必须在冰上解冻并且仅可冻融一次。
  6. 基于细胞的测定缓冲液片剂 (#27868)：溶解在 100 毫升 RODI 水中。（该缓冲液在室温下应稳定保存大约一年。）
  7. Triton™ X-100 (10%)：#86488
LDH 反应液

要制备 10ml LDH 反应液，足以在一个 96 孔板上使用，请将 100ul 以下物质添加到 9.6ml 检测缓冲液中：

  • NAD⁺ (100X)：#95899
  • 乳酸（100100X）：#23346
  • INT (100X)：#34743
  • 复溶的心肌黄酶

任何剩余的 LDH 反应液在使用后应丢弃，因为它不稳定。如果实验中使用少于一个完整的 96 孔板，请相应地调整每种反应物的体积。将剩余的 INT (100X) 储存在 -20°C 下。将 NAD+ (100X) 和乳酸 (100X) 储存在 4°C 下。

其他试剂（未提供）
  1. 酶标仪能够测量在 490-520 nm 之间的吸光度。
  2. 平板离心机
  3. 轨道摇床
  4. 平底、透明 96 孔测定板

B. 测定的具体注意事项

注：用于补充生长培养基（胎牛血清等）的血清含有 LDH，即使在没有细胞死亡的情况下，它也会与 LDH 反应溶液发生反应并引起“背景”颜色变化 (A490)。培养基中血清的百分比越高，背景信号就越高。这个背景问题有两种解决方案； 在没有血清的情况下培养细胞，或在计算细胞毒性百分比之前减去所有孔的背景信号。从生长培养基中去除血清会对整体细胞活力产生负面影响，因此这可能不适用于所有细胞类型。背景信号的减少更容易，只需要在仅含有培养基的检测中添加孔，而无需添加细胞。读取反应板后，可以从所有测试孔中减去仅培养基对照产生的 LDH A490 信号。

注：不同细胞类型包含不同量的 LDH。对于具有高 LDH 水平的细胞，与具有相对低 LDH 水平的细胞相比，产生强 A490 值所需的每孔细胞更少。因此，我们建议进行初始滴定实验，以确定您计划使用的目标细胞每孔的最佳细胞数。

检测实验步骤

确定最佳靶标细胞数和生长培养基

  1. 在 96 孔板中以 103-106 个细胞/孔的密度在 200ul 培养基中接种目标细胞。在每个细胞浓度下制备六个孔。
  2. 仅将 200ul 培养基（不含细胞）添加到三个孔中（背景对照）。
  3. 三个孔加入 20ul Triton™ X-100 (10%) (#86488)，另外三个孔加入 20ul 检测缓冲液，在室温孵育 一小时。
  4. 将 96 孔组织培养板以 400 x g 离心 5 分钟（可选但推荐）。
  5. 将 100ul 细胞上清液转移到新的 96 孔检测板中。
  6. 向每个孔中加入 100ul LDH 反应液。（去除在此步骤中产生的每个孔中的气泡）
  7. 在 37°C 避光下，在轨道摇床上轻轻摇动培养板 30 分钟。
  8. 使用读板器读取 490 nm 处的吸光度。
  9. 用含有低血清 (0-2%) 和高血清 (10-20%) 的培养基重复上述测定，以评估血清对细胞活力（自发释放）和背景的影响，或在初始测定中包括额外的孔以适应此变量。

进行细胞毒性测定

  1. 在 96 孔板中以先前确定的最佳密度在 200ul 培养基中接种靶标细胞。
  2. 将 200ul 培养基（不含细胞）添加到三个用于背景控制的孔中，并添加到三个用于 LDH 阳性对照的孔中（可选）。
  3. 将 20ul Triton™ X-100 (10%) (#86488) 溶液添加到三个含有细胞的孔中（最大释放量）和 20ul 的检测缓冲液到三个孔中 （自发释放）。将 20ul LDH 阳性对照加入到三个孔 中（可选）。
  4. 将 20ul 的实验细胞毒剂加入适当的孔中，一式三份。
  5. 在 37°C 的 CO2 培养箱中孵育该反应板，以达到您的实验诱导细胞毒性所需的时间长度。
  6. 将 96 孔组织培养板以 400 x g 离心 5 分钟（可选但推荐）。
  7. 将 100ul 细胞上清液转移到新的 96 孔检测板中。
  8. 向每个孔中加入 100ul LDH 反应液。（去除在此步骤中产生的每个孔中的气泡）
  9. 在 37°C 避光下，在轨道摇床上轻轻摇动培养板 30 分钟。
  10. 使用读板器读取 490 nm 处的吸光度。
  11. 从所有孔中减去背景 A490 水平。
  12. 按如下所述计算细胞毒性百分比：
    Cytotoxicity Equation

实验步骤编号：2504

产品说明

LDH 细胞毒性检测试剂盒可用于定量测量对化学化合物的细胞毒性，以及使用偶联的两步比色反应检测细胞介导的细胞毒性。在第一步中，乳酸脱氢酶 (LDH) 通过将乳酸氧化为丙酮酸来催化 NAD+ 还原为 NADH 和 H+。在反应的第二步中，心肌黄酶使用新形成的 NADH 和 H+ 催化四唑盐 (INT) 还原为高度着色的甲䐶，后者在 490-520 nm 处有强烈吸收。由于细胞毒性，产生的甲䐶量与释放到培养基中的 LDH 量成正比。

在原型细胞毒性测定中，靶细胞与细胞毒性化学试剂或细胞毒性细胞（例如 NK 细胞）一起培养，以诱导靶细胞死亡和 LDH 释放。将含有 LDH 的上清液转移到新检测板的孔中，并与 LDH 反应溶液混合。在室温下孵育 30 分钟后，使用酶标仪读取 490 nm (A490) 处的吸光度。用细胞毒剂或细胞毒细胞处理的细胞会释放一定量的 LDH，其量介于最大释放控制水平和自发释放控制水平之间。

背景

细胞死亡可以通过细胞凋亡（一种涉及信号转导级联的高度调节的生化途径）或坏死发生。坏死伴随着线粒体肿胀和质膜通透性增加，而细胞凋亡涉及细胞的独特分解为膜结合的凋亡小体 (1)。有许多试验旨在测量细胞毒性和细胞死亡，而与机制无关。大多数这些测定通过测量质膜通透性 (2) 来评估细胞活力。

乳酸脱氢酶 (LDH) 是一种稳定的可溶性酶，位于许多不同细胞类型的细胞质中。当质膜受损时，酶被释放到周围的培养基中。因此，培养基中的 LDH 活性可用作细胞膜完整性的可靠指标，因此可用作细胞毒性的测量。

有限使用

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