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Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (II)
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Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (II) #13296

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图 1. 对未标记（黑色）或用 200 nM TMRE 标记且用 0 μM CCCP（蓝色）、3.2 μM CCCP （绿色）或 80 μM CCCP（红色）处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。
图 2. 对接种在底部透明的黑色 96 孔板上且孵育过夜的 NIH/3T3 细胞（2x105 个细胞/ml）进行共聚焦免疫荧光分析。细胞不用处理或用 CCCP（400 μM，20 分钟）处理后用 TMRE（200 nM，30 分钟）标记。
图 3. HeLa 细胞（3x105 个细胞/ml）用不同浓度的 CCCP 处理 15 分钟后再用 200 nM TMRE 标记。
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13296S		 1 个试剂盒（500 次检测；96 孔样式）

Custom Formulation

产品包括 数量（计数） 溶液颜色
TMRE 1 x 29 µg 紫色
CCCP 1 x 100 µl 黄色
Phosphate Buffered Saline (PBS-20X) 9808 1 x 25 ml

实验步骤

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#13296 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (II) 实验步骤

A. 溶液与试剂

  1. 1X PBS：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效纯净水稀释 20X PBS（包括在每个试剂盒中，#9808）以进行制备。

    注意：对于流式细胞术，添加 0.5% BSA 到洗涤缓冲液中可有助于防止细胞在该过程中丢失。

  2. TMRE：添加 55 µl DMSO (#12611) 到每小瓶 TMRE 中，以配制 1000 µM 原液。每小瓶包含的 TMRE 足以进行 5 次 96 孔板（0.1 µl/孔）检测或 50 次流式细胞检测（10 µl/检测）。分装（如需要）并保存在 -20°C 下。用总细胞培养基按 1:500 的比例稀释 TMRE，以配制 10X TMRE Labeling Solution。该实验步骤中使用 2 µM；根据不同细胞系建议使用 0.1 至 10 µM。
  3. CCCP：如果 CCCP 用作阳性对照，用前让 CCCP 溶液平衡至室温。

B. 检测程序

对于悬浮细胞

  1. 按 1 x 106 个细胞/ml 的浓度在加热的培养基或 PBS 中悬浮细胞。制备 1 ml 等量样品；每 1 ml 细胞等量样品为一次检测点。确保有足够的细胞进行实验。例如，如果一种化合物要按三种不同浓度进行检测，则共需要 4 x 1 ml 样品（这包含阳性对照）。
  2. 按所需浓度添加检测化合物到样品试管中，并按所需时间孵育细胞。要获得最佳结果，化合物滴定和孵育时间可帮助确定最佳的检测条件。要制备阳性对照（线粒体膜电位丢失），添加 1 µl 50 mM CCCP（试剂盒中提供）到对照试管中，直至达到 50 µM 的最终浓度；细胞在 37°C 下孵育 15 分钟。
  3. 向每份样品添加 100 µl 2 µM TMRE Labeling Solution（200 nM 最终浓度），细胞在孵育器中孵育（37°C，5% CO2）15 至 30 分钟。

    注意：在该实验步骤中建议使用 200 nM TMRE。要获得最佳结果，建议滴定 TMRE。

  4. 样品以 300 g 的离心力离心分离 5 分钟，随后去除上清液。
  5. 细胞用 1 ml 加热的 1X PBS 洗涤缓冲液洗涤一次，重复步骤 4。
  6. 在 1000 µl 加热的 1X PBS 中重悬细胞。
  7. 在流式细胞分析仪上分析细胞。如果在读板机上分析样品，则按 100 µl/细胞悬浮液/孔转移到黑色、底部透明的 96-孔板，并在读板机进行读取。设置为：激发光约 550 nm，发射光约 580 nm。

对于黏附细胞

  1. 将细胞上样到 96 孔板上加热的培养基中，并在孵育器中将细胞培养过夜，以让细胞黏附在平板上。一般的细胞数目为 1-5 x 104 个细胞/孔。细胞数目滴定可能对获得最佳结果非常重要。
  2. 吸干平板上的培养基，将检测化合物添加至生长培养基或 1X PBS，以按 100 µl/孔的标准和所需浓度进行上样，并孵育细胞至所需时间。化合物滴定和孵育时间可帮助确定最佳的检测条件。对于阳性对照（线粒体膜电位丢失），添加 CCCP（试剂盒中提供）到对照孔中，直至达到 50 µM 的最终浓度，细胞在 37°C 下孵育 15 分钟。

    例如：添加 1 µl 50 mM CCCP 原液到 100 µl 培养基中，以配制 500 µM CCCP；随后添加 10 µl 这种 500 µM CCCP 到每个含有 100 µl 培养基的孔中，以获得 50 µM 的最终浓度。

  3. 向每个孔添加 10 µl 2 µM TMRE Labeling Solution，以获得 200 nM 的最终浓度，并将平板放在孵育器中（37°C，5% CO2）孵育 20 分钟。

    注意：在该实验步骤中建议使用 200 nM TMRE。要获得最佳结果，建议滴定 TMRE。

  4. 吸干平板上的溶液。
  5. 用加热的 1X PBS 洗涤平板 3 次，随后按 100 µl/孔添加 1X PBS 到板孔中。
  6. 在读板机上分析样品。设置为：激发光约 550 nm，发射光约 580 nm。

发布​时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：2057

产品说明

Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (II) 是一种检测活细胞线粒体膜电位的荧光检测试剂盒。该试剂盒包含阳离子染料 TMRE（四甲基若丹明乙酯高氯酸盐）和线粒体膜电位分配物 CCCP（羰基氰基-3-氯苯腙）。TMRE 是一种可渗透细胞膜的荧光染料，会在完整的线粒体中聚集。去极化或非活跃性线粒体会出现膜电位降低，从而减少 TMRE 积聚。

特异性/灵敏度

Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (II) 预计可检测所有物种中活细胞的线粒体膜电位。为了获得最佳结果，使用读板机和 96 孔板时，建议进行细胞数目滴定。

物种反应性：

预期的所有物种

背景

线粒体是主要的细胞动力室，在类固醇代谢、钙平衡、凋亡和细胞增殖等进程中发挥重要作用。线粒体膜电位是其功能和细胞健康的一个关键指标 (1,2)。线粒体膜电位的损耗被确定是细胞凋亡的一个早期指示 (3)。

TMRE（四甲基若丹明乙酯）是一种可渗透细胞膜的阳离子染料。在正常细胞中，高膜电位和负电荷会使 TMRE 聚集在线粒体中。以 550 nm 激发时，TMRE 会发射出橙色-红色荧光，波长最长 575 nm（橙色-红色）。丢失膜电位或线粒体活性的细胞不会聚集 TMRE。因此，橙色-红色发射光的荧光强度可用于测量线粒体膜电位，并用作细胞健康的指标 (4)。

有限使用

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