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Rapid-Act T Cell Activation Kit (Mouse, Anti-CD3/CD28)
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Rapid-Act T Cell Activation Kit (Mouse, Anti-CD3/CD28) #86772

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使用 Phospho-SLP-76 (Ser376) (E3G9U) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #47876（上图）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #2975（下图）和共染色的 CD3 (17A2) Rat mAb (APC Conjugate) #24265，对未经处理（左栏）或经 Rapid-Act T Cell Activation Kit (Mouse, Anti-CD3/CD28)（15 分钟；右栏）处理的小鼠脾细胞进行流式细胞分析。
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To Purchase # 86772S
目录# 规格 价格 库存
86772S		 1 个试剂盒（50 次测试）

Custom Formulation

产品包括 数量（计数） 保存温度
Rapid-Act Anti-mouse CD3 Hamster mAb 1 x 125 µg +4°C
Rapid-Act Anti-mouse CD28 Mouse mAb 1 x 125 µg +4°C
Rapid-Act Synthetic Immune Synapse 1 x 500 µl +4°C

保存

保存在 4ºC 下。该试剂盒中的所有组分以原始形式保存且在 4ºC 储存时均稳定 12 个月。一旦复溶，就将 Anti-mouse CD3 和 Anti-mouse CD28 储存在 -80ºC。分装，以避免多次冻融循环。

实验步骤

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#86772 Rapid-Act T Cell Activation Kit (Mouse, Anti-CD3/CD28)

A. 溶液与试剂

提供的试剂

  1. Rapid-Act Anti-mouse CD3 Hamster mAb，冻干，125 µg (#46345)
  2. Rapid-Act Anti-mouse CD28 Mouse mAb，冻干，125 µg (#63606)
  3. Rapid-Act Synthetic Immune Synapse，500 µl (#68999)

其他试剂（未提供）

  1. 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要配制 1 L 1X PBS，请将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 反渗透去离子 (RODI) 水或同等等级的水中
  2. 细胞培养基（取决于测定法）

B. 试剂配制

注：体积适用于刺激 1 x106 个细胞及其扩充。对于不同细胞数目，根据表 1 调整体积。

注：我们建议为每个实验新鲜制备 Rapid-Act CD3/CD28 复合物。如有必要，将预混合的组分储存在 4 °C 。切勿冷冻。

  1. 将每种 Rapid-Act 抗体溶解在 500 μl 1X PBS 中。将 Rapid-Act 抗体混悬液分装储存在 -80 °C。
  2. 在微量离心管中，将 10 µl Rapid-Act Anti-mouse CD3 与 10 µl Rapid-Act Anti-mouse CD28 合并。混匀。加入 10 μl Rapid-Act Synthetic Immune Synapse 并充分混合。在 20°C 孵育混合物至少 4 分钟，以生成 Rapid-Act CD3/CD28 复合体。

C. 细胞制备

  1. 通过离心法收集目标细胞和沉淀物。可以使用脾细胞、富集的 T 细胞或细胞系。每个步骤中建议的细胞数目和体积同预分离的 T 细胞。
  2. 细胞以0.2 x 106 – 1 x 106 个细胞/ml 的浓度重悬于细胞培养基中（应滴定最佳条件）。

表 1：对不同细胞数目推荐的体积

96 孔 48 孔 24 孔
细胞数目 5 – 8 x 104 2 – 5 x 105 0.5 – 1 x 106
细胞培养基 (ml) 0.1 – 0.2 0.5 – 1.0 1.0 – 2.0
Rapid-Act CD3/CD28 复合体 (µl) 3 15 30

D. T 细胞活化和扩充程序

1. T 细胞活化

  1. 在 1 – 2 ml 细胞培养基中（或使用如上文确定的体积和细胞密度）接种 0.5 – 1 x 106 个细胞。
  2. 向细胞加入 30 μl Rapid-Act CD3/CD28 复合体并轻轻混合。根据您的实验设置，将细胞悬液在 37°C 于加湿的 CO2 温箱中孵育。
  3. 收获活化的 T 细胞，通过离心用过量的 1X PBS 洗涤两次，然后直接用于进一步分析。

2. T 细胞增殖

注：活化标记物 CD25 和 CD69 应在 48 小时后上调。

  1. 遵循上文 T 细胞活化部分中的步骤 1 和 2 活化 T 细胞。
  2. 每天检查培养物，使用显微镜观察细胞大小、形状和簇形成。至少每 2-3 天计数一次细胞，以评估细胞密度；不要超过 2.5 x 106 个细胞/ml。如果细胞培养基变黄或细胞密度太高，则将培养物分入适当大小的新容器，恢复 0.2 – 1 x 106 个细胞/ml 的密度。
  3. 培养 2- 3 天后可能需要重新刺激细胞，通常在 7- 10 天后出现耗竭迹象。如 T 细胞活化中所述，反复添加 Rapid-Act CD3/CD28 复合体以重新刺激细胞。
  4. 将活化的 T 细胞收获，通过离心用过量的 1X PBS 洗涤两次，然后直接用于进一步分析。

实验步骤编号：2845

产品说明

Rapid-Act T Cell Activation Kit (Mouse, Anti-CD3/CD28) 提供了单步骤诱导小鼠 T 细胞活化和增殖的必要试剂。包含的 Synthetic Immune Synapse 颗粒预先簇集 CD3 抗体和 CD28 抗体以彻底活化 T 细胞，并且小到足够最大限度减少细胞结团。由于试剂按单步骤添加到细胞，因此该试剂盒可以对短期 T 细胞刺激进行准确的时程研究。该试剂盒还可用于长期 T 细胞增殖和耗竭测定法。在后续通过流式细胞术分析之前，无需调整或移除。

特异性/灵敏度

物种反应性：

小鼠

背景

T 细胞由途经与 T 细胞受体缔合的含 ITAM（基于免疫受体酪氨酸的活化基序）的 CD3 信号转导链的信号转导过程活化 (1)。通过 T 细胞上 CD28 的共刺激作用提供了有效活化 T 细胞所需的额外信号(2) 。基于抗体的 CD3 和 CD28 蛋白结合和聚集模拟 T 细胞与抗原呈递细胞接合，并导致 T 细胞活化。

有限使用

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