Senescence β-Galactosidase Activity Assay Kit (Fluorescence, Plate-Based) #23833

衰老β-半乳糖苷酶活性测定试剂盒 - 基于反应板的实验步骤

A. 溶液与试剂

提供的试剂

1. 1X 衰老细胞裂解缓冲液： (#91029)
2. 2X 衰老反应缓冲液： (#78494)
3. SA-β-Gal 底物：（#45954）在 348 µL DMSO 中重新配制小瓶 SA-β-Gal 底物，制成 20X 溶液。从复原之日起，将任何未使用的底物存放在 -20°C 下最多 1 个月。
4. 衰老 Stop Solution： (#66008)

其他试剂（未提供）

1. β-巯基乙醇（BME）
2. DMSO（二甲基亚砜）无菌：(#12611)
3. PMSF：(#8553) 在 1.0 ml 异丙醇中重新配制 34.84 mg 冻干的 PMSF，制成200 mM 溶液。
4. Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X): (#5872)
5. Phosphate Buffered Saline (PBS-20X)：(#9808) 要制备 1X 溶液，请向 9.5 mL 去离子水中加入0.5 mL 20X PBS。
6. 在 C. 部分测试步骤 1 中找到的初始反应的 96 孔板。
7. 适用于荧光板读取器的 96 孔黑色不透明板。
8. 荧光板读取器能够读取 360 nm 的激发波长和 465 nm 的发射波长。
9. BCA Protein Assay Kit: (#7780)
10. 高速离心机

试剂	96 孔	24 孔	6 孔	10cm 培养皿
1X PBS 洗涤液	100 µL	400 µL	1000 µL	1500 µL
1X 细胞裂解缓冲液	100 µL	400 µL	1000 µL	1500 µL

B. 制备细胞裂解物

注意：在使用该试剂盒开始测定之前，应完成诱导衰老的细胞治疗。确保包括未处理的对照物，以提供荧光的基线测量值以进行比较。

1. 在组织培养容器中培养目标平板细胞，并在适当条件下进行培养以产生衰老细胞。
2. 在使用前立即准备 1X 衰老细胞裂解缓冲液； 向溶液中加入适量的蛋白酶抑制剂，例如 1.0 mM PMSF 和蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物。使溶液裂解时，将溶液保持在冰上。请参考提供的表格，根据细胞培养容器的大小计算需要多少体积。
3. 从装有被分析细胞的容器中吸出培养基。
4. 用冷的 1X PBS 洗涤细胞一次（正确的体积请参考下表），然后吸出并丢弃洗涤液。
5. 向细胞中加入冷的 1X 衰老细胞裂解缓冲液（请参阅 B 节“步骤2”）（请参阅表格以获取正确的体积）。在冰上孵育 5 分钟。
6. 从表面刮下细胞，然后将整个裂解液转移到微量离心管中。上下吸移裂解液几次，以促进裂解过程。
7. 将装有细胞裂解物的微量离心管放入离心机中，并在 4°C 旋转5分钟（x14000 rpm）。
8. 将上清液转移到新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。
9. 可选，通过蛋白质检测来确定每个细胞裂解物样品的总蛋白浓度。

C. 检测程序

2X 分析缓冲液的制备：即将使用前，将 BME 加入终浓度为 10 mM 的 2X 衰老反应缓冲液中。然后用含 10mM BME 的 2X 衰老反应缓冲液将 20XSA-β-Gal 底物稀释至 1X。仅对已分析的孔数（每孔 50 µL）提供足够的溶液。立即使用 2X 分析缓冲液，并正确丢弃任何未使用的溶液。

1. 将 50 µL 细胞裂解液转移到 96 孔板中。加入 50 µL 新鲜配制的 2X 检测缓冲液。在避光的 37°C 下孵育样品 1-3 小时。
2. 移出 50 µL 反应混合物，然后转移至 96 孔黑色不透明板中。
3. 通过向每个孔中加入200 µL 衰老 Stop Solution 来终止反应。
4. 使用 360nm 的激发波长和 465nm 的发射波长读取荧光读板机上的荧光。要获得最佳读数，则在添加 STOP Solution 分钟内读取平板。