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64936
TUNEL Assay Kit (Fluorescence, 640 nm)
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TUNEL Assay Kit (Fluorescence, 640 nm) #64936

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使用 TUNEL 检测试剂盒（荧光，640 nm）（红色）对石蜡包埋的人结肠癌组织进行共聚焦分析，然后用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb #9664（绿色）和 DAPI #4083（蓝色） 染色。
使用 TUNEL 检测试剂盒（荧光，640 nm）（红色）和 DAPI #4083（蓝色）对石蜡包埋的 HT-29 异种移植物组织进行共聚焦分析。
使用 TUNEL 检测试剂盒（荧光，640 nm）（红色）在低倍率（左）和高倍率（右）下对固定的冷冻 E14.5 小鼠趾组织进行共聚焦分析，然后用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb #9664（绿色）和 DAPI #4083（蓝色）染色。
使用 TUNEL 检测试剂盒（荧光，640 nm）（红色）对经过 Staurosporine #9953（1 µM，3 小时；左图，阳性）处理或未经处理（右图，阴性）的 HeLa 细胞进行共聚焦分析 ，然后使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody #9661（绿色）和 DAPI #4083（蓝色）染色。
对未经处理（蓝色）或经过 Staurosporine #9953（1 μM, 3 小时，绿色）处理、未经标记（虚线）或经过 TUNEL 检测试剂盒（荧光，640 nm）（实线）标记的 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。
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64936S		 1 个试剂盒（50 次检测）

Custom Formulation

产品包括 数量（计数）
TUNEL Assay Equilibration Buffer 1 x 5 ml
CF® 640 TUNEL Reaction Buffer 5 x 500 µl
TdT Enzyme 1 x 50 µl

实验步骤

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用于石蜡包埋样品的荧光 TUNEL 实验步骤

A. 溶液与试剂

提供的试剂

注：保存于 -20°C 并避免冻/融循环。

  1. TUNEL 平衡缓冲液（1 瓶，5 mL）
  2. CF® 染料 TUNEL 反应缓冲液（5 小瓶，每小瓶 500 µL）：避光。
  3. TdT 酶（1 小瓶，50 µL）：作为 50X 浓缩液供应。使用期间保持在冰上。

重要提醒：TUNEL 平衡缓冲液和 CF® 染料 TUNEL 反应缓冲液含有二甲胂酸盐和氯化钴。遵循 SDS 操作并且作为有毒废物丢弃。

其他试剂（未提供）

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 二甲苯
  2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）。
  3. 10X Phosphate Buffered Saline (PBS)：要配制 1 L，请将 80​ g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4 g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4 g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 添加到 1 L dH2O 中。调节 pH 至 7.4。
  4. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) ：要配制 1 L 1X PBS：请将 100 ml 10X PBS 添加到 900 ml dH2O 中。
  5. 含 Triton X-100 和 BSA 的1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS-TB)：要配制 100 mL 1X PBS-TB，请将 10 mL 10X PBS、200 µL Triton X-100 和 0.5 g BSA (#9998) 添加到 90 mL dH2O 中，混合。调节 pH 至 7.4。
  6. 蛋白酶 K 溶液：为了使用，请将蛋白酶 K (#10012) 在 dH2O 中稀释至 20 µg/ml 。
  7. 1X 柠檬酸盐去掩蔽溶液（蛋白酶 K 溶液的可选替代物）：要配制 250 ml 1X 柠檬酸盐去掩蔽溶液，请将 25 ml SignalStain® 柠檬酸盐去掩蔽溶液（10X ) (#14746) 用 225 ml dH2O 稀释。

B. TUNEL 方法

一般注意事项：

  • 进行 TUNEL 测定法时，样品应保存在湿度室中。此方法期间任何时候均不允许样品干燥。
  • 所有后续孵育都应在室温（20-25°C）下进行， 除非另有说明。
  • 如果尝试与抗体共标记，建议使用热介导的抗原修复。

样品制备

  1. 脱石蜡/再水化：
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
  2. 洗涤：在 PBS 中润洗两次，每次 5 分钟。
  3. 抗原修复：将样品与蛋白酶 K 溶液孵育 30 分钟。孵育时间和温度可能需要根据组织类型优化。
    1. 或者，可以使用柠檬酸盐去掩蔽溶液：在微波炉中加热浸入 1X 柠檬酸盐去掩蔽溶液中的载玻片，直到开始沸腾； 在亚沸点温度 (95°-98°) 维持 10 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。
  4. 洗涤：在 PBS 中润洗两次，每次 5 分钟。

TUNEL 反应

  1. 准备：将样品与 100 µL 或足以覆盖样品的 TUNEL 平衡缓冲液孵育 5 分钟 。
  2. 检测：紧邻使用前，通过将 1 µL TdT 酶加入 50 µL TUNEL 反应缓冲液来配制 TUNEL 反应混合物，用于每次标记反应。移除平衡缓冲液，并将 50 µL（或足以覆盖样品）的 TUNEL 反应混合物添加至每份样品。
  3. 孵育：在 37°C 孵育 60 分钟，避光。组织切片可能需要在 37°C 孵育 2 小时，也需避光。
  4. 洗涤：在 PBS-TB 中润洗 3 次，每次 5 分钟。
  5. 共标记：如果需要，继续进行免疫染色以共标记。有关推荐的染色条件，请参考制造商的实验步骤。
  6. 封装：将样品封装于兼容性抗淬灭介质中，例如 ProLong® Gold Antifade Reagent (#9071)。

实验步骤编号：2624

用于培养细胞和冷冻组织的荧光 TUNEL 实验步骤

A. 溶液与试剂

提供的试剂

注：保存于 -20°C 并避免冻/融循环。

  1. TUNEL 平衡缓冲液（1 瓶，5 mL）。
  2. CF® 染料 TUNEL 反应缓冲液（5 小瓶，每小瓶 500 µL）：避光。
  3. TdT 酶（1 小瓶，50 µL）：作为 50X 浓缩液供应。使用期间保持在冰上。

重要提醒：TUNEL 平衡缓冲液和 CF® 染料 TUNEL 反应缓冲液含有二甲胂酸盐和氯化钴。遵循 SDS 操作并且作为有毒废物丢弃。

其他试剂（未提供）

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 10X Phosphate Buffered Saline (PBS)：要配制 1 L，请将 80​ g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4 g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4 g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 添加到 1 L dH2O 中。调节 pH 至 7.4。
  2. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) ：要配制 1 L 1X PBS：请将 100 ml 10X PBS 添加到 900 ml dH2O 中。
  3. 含 Triton X-100 和 BSA 的1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS-TB)：要配制 100 mL 1X PBS-TB，请将 10 mL 10X PBS、200 µL Triton X-100 和 0.5 g BSA (#9998) 添加到 90 mL dH2O 中，混合。调节 pH 至 7.4。
  4. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)：新鲜使用。

B. TUNEL 方法

一般注意事项：

  • 进行 TUNEL 测定法时，样品应保存在湿度室中。此方法期间任何时候均不允许样品干燥。
  • 所有后续孵育都应在室温（20-25°C）下进行， 除非另有说明。
  • 贴壁培养物中凋亡细胞松散贴壁，可能在洗涤期间丢失。如果需要，可以在上清液中捕获这些细胞并使用。

固定和通透

  1. 固定：样品应使用温和的交联性固定剂固定。
    1. 细胞：在 4% 甲醛中孵育 15 - 30 分钟。
    2. 未固定的冷冻组织：冷冻切制后，允许样品短暂达到室温并干燥，然后在 4% 甲醛中孵育 15 - 30 分钟。
    3. 固定的冷冻组织：直接推进到以下透化（步骤 3）。
  2. 洗涤：在 PBS 中润洗两次，每次 5 分钟。
  3. 透化：在 PBS-TB 中孵育 30 分钟。
  4. 洗涤：在 PBS 中润洗两次，每次 5 分钟。

TUNEL 反应

  1. 准备：将样品与 100 µL（或足以覆盖样品）TUNEL 平衡缓冲液孵育 5 分钟。
  2. 检测：紧邻使用前，通过将 1 µL TdT 酶加入 50 µL TUNEL 反应缓冲液来配制 TUNEL 反应混合物，用于每次标记反应。移除平衡缓冲液，并将 50 µL（或足以覆盖样品）的 TUNEL 反应混合物添加至每份样品。
  3. 孵育：对于细胞染色，在 37°C 孵育 60 分钟，避光。组织染色可能需要在 37°C 孵育长达 2 小时，也需避光。
  4. 洗涤：在 PBS-TB 中润洗 3 次，每次 5 分钟。
  5. 共标记：如果需要，继续进行免疫染色。参看制造商的建议，以确认一抗与这个实验步骤的固定和透化条件兼容。否则继续执行步骤 6。
  6. 封装：将样品封装于兼容性抗淬灭介质中，例如 ProLong® Gold Antifade Reagent (#9071)。

实验步骤编号：2608

用于流式细胞术的荧光 TUNEL 实验步骤

A. 溶液与试剂

提供的试剂

注：保存于 -20°C 并避免冻/融循环。

  1. TUNEL 平衡缓冲液（1 瓶，5 mL）。
  2. CF® 染料 TUNEL 反应缓冲液（5 小瓶，每小瓶 500 µL）：避光。
  3. TdT 酶（1 小瓶，50 µL）：作为 50X 浓缩液供应。使用期间保持在冰上。

重要提醒：TUNEL 平衡缓冲液和 CF® 染料 TUNEL 反应缓冲液含有二甲胂酸盐和氯化钴。遵循 SDS 操作并且作为有毒废物丢弃。

其他试剂（未提供）

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：要配制 1 L 1X PBS：请将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水中。
  2. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604) 或细胞透化缓冲液 (Triton™ X-100) (#39487)
  4. （可选）抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或通过在 100 ml 1X PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 配制 0.5% BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。

B. TUNEL 方法

一般注意事项：

  • 此方法期间任何时候均不允许样品干燥。
  • 除非另有备注，否则所有孵育均应在室温（20-25°C）进行 。

固定

    注：固定前，贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

    注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

    注：如果使用全血，则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。继续进行透化步骤。
    1. 或者，细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

透化

注：完成 TUNEL 反应需要透化。如果免疫染色将作为 TUNEL 测定法的一部分进行，请选择与贵测定法中所用的这种或多种抗体兼容的透化方法。

  1. 通过温和涡旋混合的同时，向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度，使细胞透化。
  2. 在冰上透化最短 10 分钟。
  3. 继续进行 TUNEL 反应或将细胞在 90% 甲醇中保存于 -20°C。

或者，以细胞透化缓冲液 (Triton™ X-100) (#39487) 透化，每 100 万个细胞使用大约 100 µl。在室温孵育 10 分钟。

TUNEL 反应

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 如必要，将所需数目的细胞分装到试管或孔中。（通常，每次分析 5x105 至 1x106 个细胞。）
  2. 通过离心分离，用过量的 1X PBS 来洗涤细胞。将上清液弃于合适的废液缸中。
  3. 将样品与 100 µl TUNEL 平衡缓冲液孵育 5 分钟。
  4. 紧邻使用前，通过将 1 µl TdT Enzyme 加入 50 µl TUNEL Reaction Buffer 来配制 TUNEL 反应混合物，用于每个标记反应。通过离心使细胞沉淀，移除平衡缓冲液并向每份样品加入 50 µl TUNEL 反应混合物。
  5. 在 37°C 孵育 60 分钟，避光。
  6. 用 1X PBS 进行离心分离来洗涤。弃去上清液。重复。
  7. 如果需要，继续进行免疫染色。否则继续步骤 8。
  8. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上分析。

实验步骤编号：2664

产品说明

TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记）是一种将荧光团偶联的核苷酸以酶促方式连接到片段化 DNA 的 3' 末端的方法。由于 DNA 片段化是细胞凋亡的标志，因此 TUNEL 测定法已成为一种原位监测细胞凋亡的行之有效方法。

TUNEL 检测试剂盒（荧光，640 nm）为您提供在固定的细胞或组织中完成 TUNEL 反应所需的缓冲液、酶和 dUTP 荧光团偶联物。该试剂盒意在配合荧光显微镜和/或流式细胞术使用。

荧光特性

  • 激发最大值 = 642 nm/发射最大值 = 662 nm

特异性/灵敏度

组织处理或细胞降解可能导致对非凋亡细胞中的细胞核标记。

背景

凋亡是一种受调控的细胞自杀机制，其特征在于核浓集、细胞皱缩、膜空泡化和 DNA 片段化 (1)。在细胞凋亡晚期期间，DNA 被核酸内切酶片段化，该酶将染色质切割成核小体单位，这些单位可以在凝胶上作为 DNA 梯状物可视化 (2)。DNA 片段化也充当使用 TUNEL 测定法 (3) 原位监测细胞凋亡的基础。在该测定法中，末端脱氧核苷酸转移酶以酶促方式将荧光团偶联的核苷酸掺入片段化 DNA 的 3' 末端。可以依据完整细胞内部 TUNEL 染色的增加来监测凋亡。

有限使用

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