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56795
DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN)
ChIP 试剂盒与试剂
ChIP 试剂盒
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DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795

引用 (2)
筛选器：
  1. ChIP
  2. C&R
图 1. 使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 对 4 x 106 个 HCT 116 细胞的交联染色质和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) #47538 将 50 ng、5 ng 或 0.5 ng 富集的 ChIP DNA 或 50 ng 输入 DNA 制成 DNA 库，DNA 库合成一份样品，并在 Illumina Next-Seq 平台上进行测序。结果图显示在 GAPDH 内结合，GAPDH 是 H3K4me3 的一种已知靶基因。欲知其他 ChIP-seq 情况，请下载产品说明书。
图 2. 使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 对 4 x 106 个 HCT 116 细胞的交联染色质和 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) #47538 将 50 ng、5 ng 或 0.5 ng 富集的 ChIP DNA 或 50 ng 输入 DNA 制成 DNA 库，DNA 库合成一份样品，并在 Illumina Next-Seq 平台上进行测序。结果图显示在 CaMK2D 内结合，CaMK2D 是 TCF4/TCF7L2 的一种已知靶基因。欲知其他 ChIP-seq 情况，请下载产品说明书。
图 3. 对使用不同数量的起始 ChIP DNA 生成的 ChIP-seq 数据进行集合基因分析。对 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751（左图）和 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569（右图）ChIP-seq 数据进行的分析表明，在全基因组中发现的波峰处信噪比与所有三种起始数量的 ChIP DNA 均相似。
图 4. 从使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 所生成的不同起始量 ChIP DNA 中制备的 DNA 文库的 Agilent Bioanalyzer System 特征。将 50 ng (A)、5 ng (B) 和 0.5 ng (C) 富集的 ChIP DNA 和 50 ng (D) 输入 DNA 制成 DNA 库。如图所示，每次 DNA 库的制备均表明 DNA 片段大小相似（预期范围为 300 bp 至 900 bp）。
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图 5. 使用 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和 3.6 ng CUT&RUN DNA 生成的 CUT&RUN NGS 数据，如表 2 所述。该图显示跨染色体 12（上图）的结合，包括 GAPDH（H3K4me3 的已知靶基因）（下图）。
图 6. 使用 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 和 0.7 ng CUT&RUN DNA 生成的 CUT&RUN NGS 数据，如表 2 所述。该图显示在染色体 8（上图）内的结合，包括 MYC（TCF4/TCF7L2 的已知靶基因）（下图）。
图 7. 使用 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499 和 3.1 ng CUT&RUN DNA 生成的 CUT&RUN NGS 数据，如表 2 所述。该图显示了跨染色体 7（上图）的结合，包括 ACTB（Phospho-Rpb1 的已知靶基因）（下图）。
图 8. 从使用 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 生成的不同起始量 CUT&RUN DNA 中制备的 DNA 文库的 Agilent Bioanalyzer System 特征。DNA 文库自 1 ng (A)、0.5 ng (B)、0.3 ng (C) 和 0.1 ng (D) 的富集 CUT&RUN DNA 制备。如所示，每个 DNA 文库制备物都显示出相似的 DNA 片段大小。
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To Purchase # 56795S
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56795S		 1 个试剂盒（24 次检测）

Custom Formulation

产品包括 容量（计数） 保存温度
End Prep Enzyme Mix 1 x 72 µl -20°C
End Prep Reaction Buffer 1 x 168 µl -20°C
Ligation Enhancer 1 x 24 µl -20°C
Ligation Master Mix 1 x 720 µl -20°C
Q5 PCR Master Mix 1 x 600 µl -20°C

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所有组分都保存在 -20ºC 下。如果正确保存，本产品可保持稳定 12 个月。

实验步骤

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DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN)

下一代测序分析 (NG-seq) 是一种可以在染色质免疫沉淀 (ChIP) 及核酸酶靶向切割和释放 (CUT&RUN) 测定法下游用来跨整个基因组鉴定并定量靶标 DNA 富集情况的高通量方法。DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) 含有从 ChIP DNA 或 CUT&RUN DNA 生成高质量 DNA 测序文库供 Illumina Systems 平台上进行下一代测序分析所需的所有酶和缓冲液。快速、人性化的工作流程可最大程度地缩短产生和纯化 DNA 库的亲自动手时间。

每一个试剂盒组分均进行严格的质控，并且对于每一个新批次，都在 Illumina Systems 测序平台上通过构建和测序带有索引的文库来对整套试剂进行功能性验证。

本产品必须联合 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 使用。本产品包含数量足以进行 24 次反应的试剂，并且兼容于酶解片段化或超声处理片段化、ChIP 富集的 DNA 和 CUT&RUN DNA 二者（针对富集自 ChIP 测定法或 CUT&RUN 测定法的 DNA 实验步骤不同）。

兼容性检测试剂盒：
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580
Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538
CUT&RUN Assay Kit #86652

不适合的 SimpleChIP® 试剂盒：
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002 和
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004。
注：琼脂糖微珠会封阻经超声处理的鲑鱼精 DNA，这会污染 DNA 库制备和 NG-seq。

所需试剂
试剂包括：

  1. •（绿色）End Prep Enzyme Mix #73416
  2. •（绿色）End Prep Reaction Buffer #93209
  3. •（红色）Ligation Master Mix #46719
  4. •（红色）Ligation Enhancer #30147
  5. •（蓝色）Q5 PCR Master Mix (2X) #67488

未包括的试剂：

  1. Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538
  2. Nuclease-free Water #12931
  3. AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
  4. 80% 乙醇（新鲜制备）
  5. 1X TE（10 mM Tris-HCl，pH 为 8.0，1 mM EDTA）
  6. 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）
  7. 磁力架/支架
  8. Agilent Bioanalyzer Systems and Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)
  9. PCR 试管和 PCR 仪器

针对 ChIP DNA 的 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems 实验步骤

安全停止 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。

I. 结束制备

进行 ChIP-seq 时，必须生成一个对照 DNA 测序库，用于确定在 ChIP 分析和 DNA 库制备过程中引起的 DNA 富集是否有任何实验偏差。用输入染色质（即用于进行免疫沉淀的染色质）纯化的 DNA 通常用来生成对照 DNA 库。起始原料： 500pg – 1 μg ChIP DNA。为确保 DNA 测序库的最佳多样性，我们建议在转录因子和辅助因子 ChIP-seq 中使用 5 ng 经 ChIP 富集的 DNA，在总组蛋白或组蛋白修饰 ChIP-seq 中使用 50 ng 经 ChIP 富集的 DNA，在对照 DNA 测序库中使用 50 ng 输入 DNA。如有必要，在库的生成中使用少于 5 ng 经 ChIP 富集的 DNA，但由于扩增过程中存在 PCR 偏差，这可能会导致库的多样性程度较低。开始之前：

  • Thaw End Prep Reaction Buffer (•) at room temperature.
  • 制备 1X TE（10 mM Tris-HCl，pH 为 8.0，1 mM EDTA）。
  1. 用无菌、不含核酸酶的试管制备 0.5-50 ng ChIP DNA 和相对输入 DNA（对照 DNA）。添加 1X TE，让每份 DNA 样品的最终体积为 50 μl。
  2. 往每份 DNA 样品中添加 3 μl End Prep Enzyme Mix (•) 和 7 μl End Prep Reaction Buffer (•)，使总反应体积为 60 μl。
  3. 上下吹打至少 10 次以彻底混合反应物，并快速旋转一次以收集试管壁上的所有液体。少量气泡并不会干扰实验的进行。
  4. 放在热循环仪中，并进行以下流程：
    • 在 20 °C 下保存 30 分钟
    • 在 65 °C 下保存 30 分钟
    • 保持在 4 °C 下
  5. 继续进行接头蛋白连接（第二部分）。如有必要，将样品保存在 -20°C 下，但可能会观察到少量产率损失（约 20%）。我们建议在停止之前继续进行接头蛋白连接。

II. 接头蛋白连接

在开始之前：

  • Adaptor for Illumina Systems (•) 和 USER Enzyme (•) 均可在 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中找到。
  • 在室温解冻 Adaptor for Illumina Systems (•)。
  • 上下吹打几次以混合 Ligation Master Mix。
  • 制备每份样品大约需 2.5 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
  1. 将 Adaptor for Illumina Systems (•) 在 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 中稀释。If starting DNA is 5 ng to 100 ng, dilute the adaptor 1:10 to generate a working concentration of 1.5 μM. If starting DNA is less than 5 ng, dilute the adaptor 1:25 to generate a working concentration of 0.6 μM.
  2. 将 30 μl Ligation Master Mix (•)、1 μl Ligation Enhancer (•) 和 2.5 μl 稀释的 Adaptor for Illumina Systems 直接加入 60 μl End Prep Reaction Mixture（源于第一部分的步骤 5）。
    注：不建议提前配制含有已稀释适配体的反应预混物。
  3. 通过上下抽吸至少 10 次彻底混合连接反应，然后进行快速离心以从管侧壁收集所有液体。Ligation Master Mix 极具黏性。应注意确保连接反应物的充分混合，因为混合不完全会导致连接效率降低。少量气泡并不会干扰实验的进行。
  4. 在室温下孵育 15 分钟。
  5. 向连接混合物添加 3 μl USER Enzyme (•)。混匀并在 37°C 下孵育 15 分钟，加热盖设置为 ≥ 47°C。
  6. 继续清除接头蛋白连接的 ChIP DNA（第三部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下，过夜。

III. 清除接头蛋白连接的 ChIP DNA，无需进行大小选择。

在清除接头蛋白连接的 ChIP DNA 的阶段，不建议进行大小选择，因为它会导致 ChIP-seq DNA 库的产率和多样性急剧下降。

在开始之前：

  • 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
  • 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
  • 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
  • 制备每份样品需 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
  1. 向每个接头连接反应物添加 87 μl (0.9X) 重悬的 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
  4. 一旦溶液变澄清，便小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  5. 在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  6. 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。注：请勿过度风干磁珠。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果磁珠开始破裂，则说明磁珠太干燥。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
  9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。一旦溶液变澄清，便将 15 μl 含有 DNA 靶标的上清液转移到新的 PCR 试管中。继续对接头蛋白连接的 ChIP-DNA 进行 PCR 富集（第四部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。

IV. 对接头蛋白连接的 ChIP DNA 进行 PCR 富集

在开始之前：

  • Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 中提供 Universal PCR Primer for Illumina Systems (•) 和十二种 Index Primers for Illumina Systems (•)。如与 Single Index Primers (#29580) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index Primer。请参阅 #29580 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中提供八种 Index 5 Primers for Illumina Systems（白色盖）和十二种 Index 7 Primers for Illumina Systems（橙色盖）。如与 Dual Index Primers (#47538) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index 5 primer 和一份 Index 7 primer。请参阅 #47538 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • 在室温下解冻引物和纯化的接头蛋白连接的 ChIP DNA 片段（源于第三部分中的步骤 9）。
  1. 将以下组分添加到无菌 PCR 试管中：
    试剂 1 次 PCR 反应所需的体积 (50 μl)
    纯化后的接头蛋白连接的 ChIP DNA 片段（源于第三部分中的步骤 9） 15 μl
    Q5 PCR Master Mix (•) 25 μl
    Single Index Primer for Illumina Systems (•)（或用于双重索引化的 Dual Index 7 Primer for Illumina Systems [橙色盖]） 5 μl
    Universal PCR Primer for Illumina Systems (•)（或用于双重索引化的 Dual Index 5 Primer for Illumina Systems [白色盖]） 5 μl
  2. 通过上下抽吸 10 次彻底混合反应物，并进行快速离心以从试管壁收集所有液体。
  3. 将试管放在热循环仪上，并在以下 PCR 循环条件下进行 PCR 扩增：
    a. 初始变性 98°C 30 秒
    b. 变性 98°C 10 秒
    c. 退火和延伸 65°C 15 秒
    d.

    如果起始原料为 50 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 6 次。如果起始原料为 5 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 10 次。如果起始原料为 0.5 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 13 次。

    e. 终末延伸 65°C 3 分钟
    f. 保持 4°C
  4. 继续清除 PCR 扩增物（第五部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。

V. 清除 PCR 扩增物

在开始之前：

  • 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
  • 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
  • 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
  • 制备每份样品大约需 40 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
  1. 向源于第四部分中步骤 4 的 50 μl PCR 反应添加 45 μl (0.9X) 重悬的 AMPure XP 珠 或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
  4. 小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  5. 在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  6. 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。注：请勿过度风干磁珠。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果磁珠开始破裂，则说明磁珠太干燥。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 33 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
  9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。将 30 μl 含有 DNA 靶标的上清液小心地转移到新试管中。（安全停止）可将库保存在 -20°C 下。
  10. 通过 Nanodrop 或 Picogreen 检测来测定 DNA 库的浓度。DNA 库的浓度应为 10-40 ng/μl。
  11. 使用 10mM Tris-HCl 将 1 μl DNA 库稀释至最终浓度为 5-10 ng/μl。根据制造商的说明，利用 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA 芯片，使用稀释的文库 DNA 确定大小分布。
  12. 如果观察到接头蛋白二聚物（Single Index Primer 约 128 bp 或 Dual Index Primers 约 146 bp）污染，则重复清除步骤 1-10。残留的适配体和/或适配体二聚物会严重污染测序反应。
  13. 使用 10mM Tris-HCl 稀释最终纯化的库样品，以进行高通量测序。请参阅 Illumina Systems 测序手册，了解 NG-seq 要求的最佳文库 DNA 浓度和体积。

针对 CUT&RUN DNA 的 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems 实验步骤

安全停止 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。

I. 结束制备

进行 期间CUT&RUN-seq 时，需要生成一个对照 DNA 测序文库，该文库可以用于确定 DNA 富集过程中在 CUT&RUN 测定法和 DNA 文库制备期间引入的任何实验性偏差。从输入 DNA 中纯化的 DNA（参见 CUT&RUN Assay Kit #86652 实验步骤的第五部分）通常用于生成对照 DNA 文库。起始材料：0.5ng–1 μg CUT&RUN DNA。每个反应的 CUT&RUN DNA 的典型产率为 100,000 个起始细胞 0.6 至 6 ng 。为了确保 DNA 测序文库的最佳多样性，我们建议使用您可以从 CUT&RUN 反应所获得尽可能多的 CUT&RUN DNA。如有必要，少至 0.1 ng 的 CUT&RUN DNA可以用于文库生成；然而，这可能因扩增期间 PCR 偏差而导致文库多样性较低。对于使用输入 DNA 的对照 DNA 测序文库，5 - 10 ng 是一个良好起点。请注意，需要 Picogreen 测定法测定 CUT&RUN DNA 浓度，因为单用 Nanodrop 并不足够灵敏。开始之前：

  • 在室温解冻 End Prep Reaction Buffer #93209 ( •)。如果 DTT 析出，则涡旋混合。
  • 制备 1X TE（10 mM Tris-HCl，pH 为 8.0，1 mM EDTA）。
  1. 在独立的无菌无核酸酶管中配制 0.5-10 ng CUT&RUN DNA 和相关性输入 DNA（对照 DNA）。添加 1X TE，让每份 DNA 样品的最终体积为 50 μl。
  2. 向每份 DNA 样品添加 3 μl End Prep Enzyme Mix (•) 和 7 μl End Prep Reaction Buffer (•)，以形成 60 μl 反应总体积 。
  3. 上下吹打至少 10 次以彻底混合反应物，并快速旋转一次以收集试管壁上的所有液体。少量气泡并不会干扰实验的进行。
  4. 放在热循环仪中，并进行以下流程：
    • 在 20 °C 下保存 30 分钟
    • 在 50 °C 下保存 30 分钟
    • 保持在 4 °C 下
  5. 继续进行接头蛋白连接（第二部分）。如有必要，将样品保存在 -20°C 下，但可能会观察到少量产率损失（约 20%）。我们建议在停止之前继续进行接头蛋白连接。

II. 接头蛋白连接

在开始之前：

  • Adaptor for Illumina Systems ( •) 和 USER Enzyme (•) 均可在 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中找到。
  • 在室温解冻 Adaptor for Illumina Systems ( •)。
  • 上下吹打几次以混合 Ligation Master Mix。
  • 制备每份样品大约需 2.5 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
  1. 在如表中所示的 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 中稀释 Adaptor for Illumina Systems ( •)，以避免过多适配体污染文库 DNA。
    起始 DNA 适配体稀释 适配体工作浓度
    100 ng – 1 μg 无稀释 15 μM
    5 ng – 100 ng 1:10 1.5 μM
    2.5 ng – 5 ng 1:25 0.6 μM
    1.25 ng – 2.5 ng 1:50 0.3 μM
    小于 1.25 ng 1:125 0.12 μM
  2. 将 30 μl Ligation Master Mix (•)、1 μl Ligation Enhancer (•) 和 2.5 μl 稀释的 Adaptor for Illumina Systems 直接加入 60 μl End Prep Reaction Mixture（源于第一部分的步骤 5）。
    注：不建议提前配制含有已稀释适配体的反应预混物。但是，如果在 4°C 放置 < 8 小时，则允许使用 Ligation Master Mix 和 Ligation Enhancer 的预混物。
  3. 通过上下抽吸至少 10 次彻底混合连接反应，然后进行快速离心以从管侧壁收集所有液体。Ligation Master Mix 极具黏性。应注意确保连接反应物的充分混合，因为混合不完全会导致连接效率降低。少量气泡并不会干扰实验的进行。
  4. 在室温孵育至少 15 分钟。
  5. 向连接混合物添加 3 μl USER Enzyme ( •)。混匀并在 37°C 下孵育 15 分钟，加热盖设置为 ≥ 47°C。
  6. 继续清除适配体连接型 CUT&RUN DNA（第三部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下，过夜。

III. 不进下行大小选择情况清除适配体连接型 CUT&RUN DNA。

在清除适配体连接型 CUT&RUN DNA 阶段期间不建议进行大小选择，因为这导致 DNA 文库产率和多样性骤降。

在开始之前：

  • 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
  • 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
  • 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
  • 制备每份样品需 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
  1. 向每个接头连接反应添加 106 μl (1.1X) 重悬的 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
  4. 一旦溶液变澄清，便小心清除和丢弃上清液。小心移除所有液体残留物，但勿扰动含 DNA 靶标的珠子。
  5. 在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  6. 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。注：请勿过度风干磁珠。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果珠子开始皲裂，则珠子太干。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
  9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。一旦溶液变澄清，便将 15 μl 含有 DNA 靶标的上清液转移到新的 PCR 试管中。继续对接头蛋白连接的 ChIP-DNA 进行 PCR 富集（第四部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。

IV. PCR 富集适配体连接型 CUT&RUN DNA

在开始之前：

  • Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 中提供 Universal PCR Primer for Illumina Systems ( •) 和十二种 Index Primers for Illumina Systems ( •)。如与 Single Index Primers (#29580) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index Primer。请参阅 #29580 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中提供八种 Index 5 Primers for Illumina Systems（白色盖）和十二种 Index 7 Primers for Illumina Systems（橙色盖）。如与 Dual Index Primers (#47538) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index 5 primer 和一份 Index 7 primer。请参阅 #47538 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • 在室温解冻引物和纯化的适配体连接型 CUT&RUN DNA 片段（源于第三部分的步骤 9）。
  1. 将以下组分添加到无菌 PCR 试管中：
    试剂 1 次 PCR 反应所需的体积 (50 μl)
    纯化的接头蛋白连接型 CUT&RUN-DNA 片段（源于第三部分的步骤 9） 15 μl
    Q5 PCR Master Mix ( •) 25 μl
    Single Index Primer for Illumina Systems ( •)（或用于双重索引化的 Dual Index 7 Primer for Illumina Systems [橙色盖]） 5 μl
    Universal PCR Primer for Illumina Systems (•)（或用于双重索引化的 Dual Index 5 Primer for Illumina Systems [白色盖]） 5 μl
  2. 通过上下抽吸 10 次彻底混合反应物，并进行快速离心以从试管壁收集所有液体。
  3. 将试管放在热循环仪上，并在以下 PCR 循环条件下进行 PCR 扩增：
    a. 初始变性 98°C，30 秒
    b. 变性 98°C，10 秒
    c. 退火和延伸 65°C，13 秒
    d. 对于 50 - 100 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，总计 6 - 7 次循环。
    对于 5 - 50 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，总计 8 - 12 次循环。
    用于 1 - 5 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，总计 13 - 15 次循环。
    用于 0.5 - 1 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，总计 16 - 17 次循环。
    用于 0.2 – 0.5 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，总计 18 - 19 次循环。
    用于 0.1-0.2 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，共循环 20 次
    e. 终末延伸 65°C，3 分钟
    f. 保持 4°C

     

  4. 继续清除 PCR 扩增物（第五部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。

V. 清除 PCR 扩增物

在开始之前：

  • 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
  • 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
  • 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
  • 制备每份样品大约需 40 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
  1. 向源于第四部分中步骤 4 配制的50 μl PCR 反应添加50 μl (1.0X) 重悬的 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
  4. 小心清除和丢弃上清液。小心移除所有液体残留物，但勿扰动含 DNA 靶标的珠子。
  5. 在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  6. 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。注：请勿过度风干磁珠。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果珠子开始皲裂，则珠子太干。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 33 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。注：如果需要更高浓度的文库 DNA ，可以使用更少体积的 Tris-HClpH (8.0-8.5)（例如 17 μl）。
  9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。将 30 μl 含有 DNA 靶标的上清液小心地转移到新试管中。（安全停止）可将库保存在 -20°C 下。注：如果步骤 8 中使用 17 µl Tris-HCl (pH 8.0-8.5)，则仅转移 15 µl 含 DNA 靶标的上清液至新管。
  10. 通过 Nanodrop 或 Picogreen 检测来测定 DNA 库的浓度。DNA 库的浓度应为 10-40 ng/μl。
  11. 使用 10mM Tris-HCl 将 1 μl DNA 库稀释至最终浓度为 5-10 ng/μl。根据制造商的说明，利用 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA 芯片，使用稀释的文库 DNA 确定大小分布。
  12. 如果观察到接头蛋白二聚物（Single Index Primer 约 128 bp 或 Dual Index Primers 约 146 bp）污染，则重复清除步骤 1-10。残留的适配体和/或适配体二聚物会严重污染测序反应。
  13. 使用 10mM Tris-HCl 稀释最终纯化的库样品，以进行高通量测序。请参阅 Illumina Systems 测序手册，了解 NG-seq 要求的最佳文库 DNA 浓度和体积。

附录 A：试剂盒组分的质量控制

I. End Prep Enzyme Mix (•)

说明
End Prep Enzyme Mix 经优化后可将 500 pg-1 μg 碎裂的 DNA 转化为具有 5´-磷酸化、3´-dA 尾端的已修复 DNA。

质量控制检测

  1. SDS-PAGE 纯度：对每个单独的酶进行的 SDS-PAGE 分析显示，酶纯度 > 95%。
  2. 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入至少 10 μl 这种酶混合物和 1 μg φX174 RF I DNA，并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 磷酸酶活性：在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中加入至少 10 μl 这种酶混合物，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。
  4. 功能活性（核苷酸聚合、磷酸化和 dA 拖尾）：在 1X End Repair Reaction 缓冲液中加入 1 μl 这种酶混合物，在 25°C 下孵育 20 分钟，经毛细管电泳确定，可修复和磷酸化 0.5 μg 含 3´ 和 5´ 突出端的 DNA 片段的 > 95% 末端。

II. End Prep Reaction Buffer (•)

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育：在 50 μl 反应体积中加入 1X 反应缓冲液和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1X 反应缓冲液和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入 1X 反应缓冲液和 1 μg φX174 RF I DNA，并在 37°C 下孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：将 1X 反应缓冲液和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。
  4. 磷酸酶活性：在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中加入 1X 反应缓冲液，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。

III. Ligation Master Mix (•)

说明
Ligation Master Mix 是一种即用型解决方案，包含 T4 DNA 连接酶、专有连接增强子以及优化的反应缓冲液。

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育：在 50 μl 反应体积中加入 1X Ligation Master Mix 和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1X Ligation Master Mix 和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入 1X Ligation Master Mix 和 1 μg φX174 RF I DNA，并在 37°C 下孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：将 1X Ligation Master Mix 和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。
  4. 转化检测：将 LITMUS 28 载体用 EcoRV（平端）切割，用小牛肠磷酸酶处理并且经凝胶纯化。使用 Ligation Master Mix 实验步骤，将 HaeIII 酶切 φX174 DNA 产生的钝性插入物以 3:1（插入物：载体）的比例连接在载体中。连接产物按之前所述转化。每一批均超过以下标准：

效率（转化物/µg）

重新环化 插入
钝端 > 1 x 107 > 2.5 x 106
未切割的载体 > 1 x 108 N/A

IV. Ligation Enhancer (•)

质量控制检测

  1. 16-Hour Incubation: 50 μl reactions containing 1 μl Ligation Enhancer and 1 μg of HindIII digested Lambda DNA incubated for 16 hours at 37°C results in no detectable non-specific nuclease degradation as determined by agarose gel electrophoresis. 50 μl reactions containing 1 μl NEBNext 5' SR Adaptor 3 and 1 μg of T3 DNA incubated for 16 hours at 37°C results in no detectable non-specific nuclease degradation as determined by agarose gel electrophoresis.
  2. 核酸内切酶活性：在 4 μl 反应体积中加入 1 μl Ligation Enhancer 和 1 μg φX174 RF I 超螺旋 DNA，并在 37°C 下孵育 50 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II（带切口的分子）的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：在 10 μl 反应体积中加入 1 μl Ligation Enhancer 和 40 ng RNA 转录物，并在 37°C 下孵育 16 小时，经凝胶电泳确定没有可检测的 RNA 降解。
  4. 磷酸酶活性：在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中加入 1 μl Ligation Enhancer，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。

V. Q5 PCR Master Mix (2X) (•)

说明
Q5 PCR Master Mix (2X) 经专门优化用于可靠、高精度扩增下一代测序分析 (NGS) 文库，无论 GC 含量如何。主混合物的聚合酶组分 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 是一种新型的 DNA 耐热聚合酶，它具有 3´→5´ 核酸外切酶活性，可融合至一个持续合成能力增强的 Sso7d 结构域。Q5 的错误率也超低（比 Taq DNA 聚合酶的错误率要低 100 倍以上，比强烈火球菌 (Pfu) DNA 聚合酶要低大约 12 倍）。主混合物的缓冲液组分经优化可用于实现可靠扩增，即便是含有 GC 富集的扩增子的情况，并且对各种用于典型 NGS 工作流程的珠子具有更高的适用性。这些功能使得 Q5 PCR Master Mix 理想用于 NGS 文库构建。这种便利的 2X 主混合物包含 dNTPs、Mg++ 以及专有缓冲液，并且仅需添加引物和 DNA 模板即可进行可靠扩增。内含热启动适配子，可方便进行室温反应设置。

质量控制检测

  1. 16 小时孵育：在 37°C孵育16 小时的 50 μl 含 Q5 PCR Master Mix 和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA的反应未产生可检出的非特异性核酸酶降解，如通过琼脂糖凝胶电泳所确定。在 37°C孵育16小时的 50 μl 含 Q5 PCR Master Mix 和 1 μg T3 DNA 的反应未产生可检出的非特异性核酸酶降解，如通过琼脂糖凝胶电泳所确定。
  2. 磷酸酶活性：在 37°C 孵育含 2.5 mM 磷酸对硝基苯的蛋白质磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺，pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）的 Q5 PCR Master Mix 4 小时，未产生可检出的的对硝基苯阴离子，如通过 405 nm 处分光光度计分析所确定。
  3. 功能活性（多重 PCR，磁珠抑制）：在含有 0.5 μM 4-plex 引物混合物和 1X Q5 PCR Master Mix 的 50 μl 反应中使用和不使用羧化磁珠时 20 ng 基因组 DNA 的 30 次 PCR 扩增循环产生四个预期的扩增子且在磁珠存在时不抑制扩增。

发布​时间 2017 年 11 月

修订时间 2023 年 1 月

实验步骤编号：1624

实验步骤编号：1624

DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN)

下一代测序分析 (NG-seq) 是一种可以在染色质免疫沉淀 (ChIP) 及核酸酶靶向切割和释放 (CUT&RUN) 测定法下游用来跨整个基因组鉴定并定量靶标 DNA 富集情况的高通量方法。DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) 含有从 ChIP DNA 或 CUT&RUN DNA 生成高质量 DNA 测序文库供 Illumina Systems 平台上进行下一代测序分析所需的所有酶和缓冲液。快速、人性化的工作流程可最大程度地缩短产生和纯化 DNA 库的亲自动手时间。

每一个试剂盒组分均进行严格的质控，并且对于每一个新批次，都在 Illumina Systems 测序平台上通过构建和测序带有索引的文库来对整套试剂进行功能性验证。

本产品必须联合 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 使用。本产品包含数量足以进行 24 次反应的试剂，并且兼容于酶解片段化或超声处理片段化、ChIP 富集的 DNA 和 CUT&RUN DNA 二者（针对富集自 ChIP 测定法或 CUT&RUN 测定法的 DNA 实验步骤不同）。

兼容性检测试剂盒：
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580
Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538
CUT&RUN Assay Kit #86652

不适合的 SimpleChIP® 试剂盒：
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002 和
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004。
注：琼脂糖微珠会封阻经超声处理的鲑鱼精 DNA，这会污染 DNA 库制备和 NG-seq。

所需试剂
试剂包括：

  1. •（绿色）End Prep Enzyme Mix #73416
  2. •（绿色）End Prep Reaction Buffer #93209
  3. •（红色）Ligation Master Mix #46719
  4. •（红色）Ligation Enhancer #30147
  5. •（蓝色）Q5 PCR Master Mix (2X) #67488

未包括的试剂：

  1. Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538
  2. Nuclease-free Water #12931
  3. AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
  4. 80% 乙醇（新鲜制备）
  5. 1X TE（10 mM Tris-HCl，pH 为 8.0，1 mM EDTA）
  6. 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）
  7. 磁力架/支架
  8. Agilent Bioanalyzer Systems and Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)
  9. PCR 试管和 PCR 仪器

针对 ChIP DNA 的 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems 实验步骤

安全停止 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。

I. 结束制备

进行 ChIP-seq 时，必须生成一个对照 DNA 测序库，用于确定在 ChIP 分析和 DNA 库制备过程中引起的 DNA 富集是否有任何实验偏差。用输入染色质（即用于进行免疫沉淀的染色质）纯化的 DNA 通常用来生成对照 DNA 库。起始原料： 500pg – 1 μg ChIP DNA。为确保 DNA 测序库的最佳多样性，我们建议在转录因子和辅助因子 ChIP-seq 中使用 5 ng 经 ChIP 富集的 DNA，在总组蛋白或组蛋白修饰 ChIP-seq 中使用 50 ng 经 ChIP 富集的 DNA，在对照 DNA 测序库中使用 50 ng 输入 DNA。如有必要，在库的生成中使用少于 5 ng 经 ChIP 富集的 DNA，但由于扩增过程中存在 PCR 偏差，这可能会导致库的多样性程度较低。开始之前：

  • Thaw End Prep Reaction Buffer (•) at room temperature.
  • 制备 1X TE（10 mM Tris-HCl，pH 为 8.0，1 mM EDTA）。
  1. 用无菌、不含核酸酶的试管制备 0.5-50 ng ChIP DNA 和相对输入 DNA（对照 DNA）。添加 1X TE，让每份 DNA 样品的最终体积为 50 μl。
  2. 往每份 DNA 样品中添加 3 μl End Prep Enzyme Mix (•) 和 7 μl End Prep Reaction Buffer (•)，使总反应体积为 60 μl。
  3. 上下吹打至少 10 次以彻底混合反应物，并快速旋转一次以收集试管壁上的所有液体。少量气泡并不会干扰实验的进行。
  4. 放在热循环仪中，并进行以下流程：
    • 在 20 °C 下保存 30 分钟
    • 在 65 °C 下保存 30 分钟
    • 保持在 4 °C 下
  5. 继续进行接头蛋白连接（第二部分）。如有必要，将样品保存在 -20°C 下，但可能会观察到少量产率损失（约 20%）。我们建议在停止之前继续进行接头蛋白连接。

II. 接头蛋白连接

在开始之前：

  • Adaptor for Illumina Systems (•) 和 USER Enzyme (•) 均可在 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中找到。
  • 在室温解冻 Adaptor for Illumina Systems (•)。
  • 上下吹打几次以混合 Ligation Master Mix。
  • 制备每份样品大约需 2.5 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
  1. 将 Adaptor for Illumina Systems (•) 在 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 中稀释。If starting DNA is 5 ng to 100 ng, dilute the adaptor 1:10 to generate a working concentration of 1.5 μM. If starting DNA is less than 5 ng, dilute the adaptor 1:25 to generate a working concentration of 0.6 μM.
  2. 将 30 μl Ligation Master Mix (•)、1 μl Ligation Enhancer (•) 和 2.5 μl 稀释的 Adaptor for Illumina Systems 直接加入 60 μl End Prep Reaction Mixture（源于第一部分的步骤 5）。
    注：不建议提前配制含有已稀释适配体的反应预混物。
  3. 通过上下抽吸至少 10 次彻底混合连接反应，然后进行快速离心以从管侧壁收集所有液体。Ligation Master Mix 极具黏性。应注意确保连接反应物的充分混合，因为混合不完全会导致连接效率降低。少量气泡并不会干扰实验的进行。
  4. 在室温下孵育 15 分钟。
  5. 向连接混合物添加 3 μl USER Enzyme (•)。混匀并在 37°C 下孵育 15 分钟，加热盖设置为 ≥ 47°C。
  6. 继续清除接头蛋白连接的 ChIP DNA（第三部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下，过夜。

III. 清除接头蛋白连接的 ChIP DNA，无需进行大小选择。

在清除接头蛋白连接的 ChIP DNA 的阶段，不建议进行大小选择，因为它会导致 ChIP-seq DNA 库的产率和多样性急剧下降。

在开始之前：

  • 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
  • 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
  • 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
  • 制备每份样品需 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
  1. 向每个接头连接反应物添加 87 μl (0.9X) 重悬的 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
  4. 一旦溶液变澄清，便小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  5. 在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  6. 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。注：请勿过度风干磁珠。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果磁珠开始破裂，则说明磁珠太干燥。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
  9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。一旦溶液变澄清，便将 15 μl 含有 DNA 靶标的上清液转移到新的 PCR 试管中。继续对接头蛋白连接的 ChIP-DNA 进行 PCR 富集（第四部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。

IV. 对接头蛋白连接的 ChIP DNA 进行 PCR 富集

在开始之前：

  • Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 中提供 Universal PCR Primer for Illumina Systems (•) 和十二种 Index Primers for Illumina Systems (•)。如与 Single Index Primers (#29580) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index Primer。请参阅 #29580 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中提供八种 Index 5 Primers for Illumina Systems（白色盖）和十二种 Index 7 Primers for Illumina Systems（橙色盖）。如与 Dual Index Primers (#47538) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index 5 primer 和一份 Index 7 primer。请参阅 #47538 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • 在室温下解冻引物和纯化的接头蛋白连接的 ChIP DNA 片段（源于第三部分中的步骤 9）。
  1. 将以下组分添加到无菌 PCR 试管中：
    试剂 1 次 PCR 反应所需的体积 (50 μl)
    纯化后的接头蛋白连接的 ChIP DNA 片段（源于第三部分中的步骤 9） 15 μl
    Q5 PCR Master Mix (•) 25 μl
    Single Index Primer for Illumina Systems (•)（或用于双重索引化的 Dual Index 7 Primer for Illumina Systems [橙色盖]） 5 μl
    Universal PCR Primer for Illumina Systems (•)（或用于双重索引化的 Dual Index 5 Primer for Illumina Systems [白色盖]） 5 μl
  2. 通过上下抽吸 10 次彻底混合反应物，并进行快速离心以从试管壁收集所有液体。
  3. 将试管放在热循环仪上，并在以下 PCR 循环条件下进行 PCR 扩增：
    a. 初始变性 98°C 30 秒
    b. 变性 98°C 10 秒
    c. 退火和延伸 65°C 15 秒
    d.

    如果起始原料为 50 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 6 次。如果起始原料为 5 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 10 次。如果起始原料为 0.5 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 13 次。

    e. 终末延伸 65°C 3 分钟
    f. 保持 4°C
  4. 继续清除 PCR 扩增物（第五部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。

V. 清除 PCR 扩增物

在开始之前：

  • 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
  • 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
  • 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
  • 制备每份样品大约需 40 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
  1. 向源于第四部分中步骤 4 的 50 μl PCR 反应添加 45 μl (0.9X) 重悬的 AMPure XP 珠 或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
  4. 小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  5. 在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  6. 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。注：请勿过度风干磁珠。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果磁珠开始破裂，则说明磁珠太干燥。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 33 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
  9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。将 30 μl 含有 DNA 靶标的上清液小心地转移到新试管中。（安全停止）可将库保存在 -20°C 下。
  10. 通过 Nanodrop 或 Picogreen 检测来测定 DNA 库的浓度。DNA 库的浓度应为 10-40 ng/μl。
  11. 使用 10mM Tris-HCl 将 1 μl DNA 库稀释至最终浓度为 5-10 ng/μl。根据制造商的说明，利用 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA 芯片，使用稀释的文库 DNA 确定大小分布。
  12. 如果观察到接头蛋白二聚物（Single Index Primer 约 128 bp 或 Dual Index Primers 约 146 bp）污染，则重复清除步骤 1-10。残留的适配体和/或适配体二聚物会严重污染测序反应。
  13. 使用 10mM Tris-HCl 稀释最终纯化的库样品，以进行高通量测序。请参阅 Illumina Systems 测序手册，了解 NG-seq 要求的最佳文库 DNA 浓度和体积。

针对 CUT&RUN DNA 的 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems 实验步骤

安全停止 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。

I. 结束制备

进行 期间CUT&RUN-seq 时，需要生成一个对照 DNA 测序文库，该文库可以用于确定 DNA 富集过程中在 CUT&RUN 测定法和 DNA 文库制备期间引入的任何实验性偏差。从输入 DNA 中纯化的 DNA（参见 CUT&RUN Assay Kit #86652 实验步骤的第五部分）通常用于生成对照 DNA 文库。起始材料：0.5ng–1 μg CUT&RUN DNA。每个反应的 CUT&RUN DNA 的典型产率为 100,000 个起始细胞 0.6 至 6 ng 。为了确保 DNA 测序文库的最佳多样性，我们建议使用您可以从 CUT&RUN 反应所获得尽可能多的 CUT&RUN DNA。如有必要，少至 0.1 ng 的 CUT&RUN DNA可以用于文库生成；然而，这可能因扩增期间 PCR 偏差而导致文库多样性较低。对于使用输入 DNA 的对照 DNA 测序文库，5 - 10 ng 是一个良好起点。请注意，需要 Picogreen 测定法测定 CUT&RUN DNA 浓度，因为单用 Nanodrop 并不足够灵敏。开始之前：

  • 在室温解冻 End Prep Reaction Buffer #93209 ( •)。如果 DTT 析出，则涡旋混合。
  • 制备 1X TE（10 mM Tris-HCl，pH 为 8.0，1 mM EDTA）。
  1. 在独立的无菌无核酸酶管中配制 0.5-10 ng CUT&RUN DNA 和相关性输入 DNA（对照 DNA）。添加 1X TE，让每份 DNA 样品的最终体积为 50 μl。
  2. 向每份 DNA 样品添加 3 μl End Prep Enzyme Mix (•) 和 7 μl End Prep Reaction Buffer (•)，以形成 60 μl 反应总体积 。
  3. 上下吹打至少 10 次以彻底混合反应物，并快速旋转一次以收集试管壁上的所有液体。少量气泡并不会干扰实验的进行。
  4. 放在热循环仪中，并进行以下流程：
    • 在 20 °C 下保存 30 分钟
    • 在 50 °C 下保存 30 分钟
    • 保持在 4 °C 下
  5. 继续进行接头蛋白连接（第二部分）。如有必要，将样品保存在 -20°C 下，但可能会观察到少量产率损失（约 20%）。我们建议在停止之前继续进行接头蛋白连接。

II. 接头蛋白连接

在开始之前：

  • Adaptor for Illumina Systems ( •) 和 USER Enzyme (•) 均可在 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中找到。
  • 在室温解冻 Adaptor for Illumina Systems ( •)。
  • 上下吹打几次以混合 Ligation Master Mix。
  • 制备每份样品大约需 2.5 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
  1. 在如表中所示的 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 中稀释 Adaptor for Illumina Systems ( •)，以避免过多适配体污染文库 DNA。
    起始 DNA 适配体稀释 适配体工作浓度
    100 ng – 1 μg 无稀释 15 μM
    5 ng – 100 ng 1:10 1.5 μM
    2.5 ng – 5 ng 1:25 0.6 μM
    1.25 ng – 2.5 ng 1:50 0.3 μM
    小于 1.25 ng 1:125 0.12 μM
  2. 将 30 μl Ligation Master Mix (•)、1 μl Ligation Enhancer (•) 和 2.5 μl 稀释的 Adaptor for Illumina Systems 直接加入 60 μl End Prep Reaction Mixture（源于第一部分的步骤 5）。
    注：不建议提前配制含有已稀释适配体的反应预混物。但是，如果在 4°C 放置 < 8 小时，则允许使用 Ligation Master Mix 和 Ligation Enhancer 的预混物。
  3. 通过上下抽吸至少 10 次彻底混合连接反应，然后进行快速离心以从管侧壁收集所有液体。Ligation Master Mix 极具黏性。应注意确保连接反应物的充分混合，因为混合不完全会导致连接效率降低。少量气泡并不会干扰实验的进行。
  4. 在室温孵育至少 15 分钟。
  5. 向连接混合物添加 3 μl USER Enzyme ( •)。混匀并在 37°C 下孵育 15 分钟，加热盖设置为 ≥ 47°C。
  6. 继续清除适配体连接型 CUT&RUN DNA（第三部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下，过夜。

III. 不进下行大小选择情况清除适配体连接型 CUT&RUN DNA。

在清除适配体连接型 CUT&RUN DNA 阶段期间不建议进行大小选择，因为这导致 DNA 文库产率和多样性骤降。

在开始之前：

  • 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
  • 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
  • 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
  • 制备每份样品需 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
  1. 向每个接头连接反应添加 106 μl (1.1X) 重悬的 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
  4. 一旦溶液变澄清，便小心清除和丢弃上清液。小心移除所有液体残留物，但勿扰动含 DNA 靶标的珠子。
  5. 在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  6. 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。注：请勿过度风干磁珠。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果珠子开始皲裂，则珠子太干。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
  9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。一旦溶液变澄清，便将 15 μl 含有 DNA 靶标的上清液转移到新的 PCR 试管中。继续对接头蛋白连接的 ChIP-DNA 进行 PCR 富集（第四部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。

IV. PCR 富集适配体连接型 CUT&RUN DNA

在开始之前：

  • Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 中提供 Universal PCR Primer for Illumina Systems ( •) 和十二种 Index Primers for Illumina Systems ( •)。如与 Single Index Primers (#29580) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index Primer。请参阅 #29580 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中提供八种 Index 5 Primers for Illumina Systems（白色盖）和十二种 Index 7 Primers for Illumina Systems（橙色盖）。如与 Dual Index Primers (#47538) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index 5 primer 和一份 Index 7 primer。请参阅 #47538 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • 在室温解冻引物和纯化的适配体连接型 CUT&RUN DNA 片段（源于第三部分的步骤 9）。
  1. 将以下组分添加到无菌 PCR 试管中：
    试剂 1 次 PCR 反应所需的体积 (50 μl)
    纯化的接头蛋白连接型 CUT&RUN-DNA 片段（源于第三部分的步骤 9） 15 μl
    Q5 PCR Master Mix ( •) 25 μl
    Single Index Primer for Illumina Systems ( •)（或用于双重索引化的 Dual Index 7 Primer for Illumina Systems [橙色盖]） 5 μl
    Universal PCR Primer for Illumina Systems (•)（或用于双重索引化的 Dual Index 5 Primer for Illumina Systems [白色盖]） 5 μl
  2. 通过上下抽吸 10 次彻底混合反应物，并进行快速离心以从试管壁收集所有液体。
  3. 将试管放在热循环仪上，并在以下 PCR 循环条件下进行 PCR 扩增：
    a. 初始变性 98°C，30 秒
    b. 变性 98°C，10 秒
    c. 退火和延伸 65°C，13 秒
    d. 对于 50 - 100 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，总计 6 - 7 次循环。
    对于 5 - 50 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，总计 8 - 12 次循环。
    用于 1 - 5 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，总计 13 - 15 次循环。
    用于 0.5 - 1 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，总计 16 - 17 次循环。
    用于 0.2 – 0.5 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，总计 18 - 19 次循环。
    用于 0.1-0.2 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，共循环 20 次
    e. 终末延伸 65°C，3 分钟
    f. 保持 4°C

     

  4. 继续清除 PCR 扩增物（第五部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。

V. 清除 PCR 扩增物

在开始之前：

  • 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
  • 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
  • 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
  • 制备每份样品大约需 40 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
  1. 向源于第四部分中步骤 4 配制的50 μl PCR 反应添加50 μl (1.0X) 重悬的 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
  4. 小心清除和丢弃上清液。小心移除所有液体残留物，但勿扰动含 DNA 靶标的珠子。
  5. 在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  6. 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。注：请勿过度风干磁珠。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果珠子开始皲裂，则珠子太干。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 33 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。注：如果需要更高浓度的文库 DNA ，可以使用更少体积的 Tris-HClpH (8.0-8.5)（例如 17 μl）。
  9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。将 30 μl 含有 DNA 靶标的上清液小心地转移到新试管中。（安全停止）可将库保存在 -20°C 下。注：如果步骤 8 中使用 17 µl Tris-HCl (pH 8.0-8.5)，则仅转移 15 µl 含 DNA 靶标的上清液至新管。
  10. 通过 Nanodrop 或 Picogreen 检测来测定 DNA 库的浓度。DNA 库的浓度应为 10-40 ng/μl。
  11. 使用 10mM Tris-HCl 将 1 μl DNA 库稀释至最终浓度为 5-10 ng/μl。根据制造商的说明，利用 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA 芯片，使用稀释的文库 DNA 确定大小分布。
  12. 如果观察到接头蛋白二聚物（Single Index Primer 约 128 bp 或 Dual Index Primers 约 146 bp）污染，则重复清除步骤 1-10。残留的适配体和/或适配体二聚物会严重污染测序反应。
  13. 使用 10mM Tris-HCl 稀释最终纯化的库样品，以进行高通量测序。请参阅 Illumina Systems 测序手册，了解 NG-seq 要求的最佳文库 DNA 浓度和体积。

附录 A：试剂盒组分的质量控制

I. End Prep Enzyme Mix (•)

说明
End Prep Enzyme Mix 经优化后可将 500 pg-1 μg 碎裂的 DNA 转化为具有 5´-磷酸化、3´-dA 尾端的已修复 DNA。

质量控制检测

  1. SDS-PAGE 纯度：对每个单独的酶进行的 SDS-PAGE 分析显示，酶纯度 > 95%。
  2. 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入至少 10 μl 这种酶混合物和 1 μg φX174 RF I DNA，并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 磷酸酶活性：在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中加入至少 10 μl 这种酶混合物，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。
  4. 功能活性（核苷酸聚合、磷酸化和 dA 拖尾）：在 1X End Repair Reaction 缓冲液中加入 1 μl 这种酶混合物，在 25°C 下孵育 20 分钟，经毛细管电泳确定，可修复和磷酸化 0.5 μg 含 3´ 和 5´ 突出端的 DNA 片段的 > 95% 末端。

II. End Prep Reaction Buffer (•)

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育：在 50 μl 反应体积中加入 1X 反应缓冲液和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1X 反应缓冲液和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入 1X 反应缓冲液和 1 μg φX174 RF I DNA，并在 37°C 下孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：将 1X 反应缓冲液和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。
  4. 磷酸酶活性：在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中加入 1X 反应缓冲液，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。

III. Ligation Master Mix (•)

说明
Ligation Master Mix 是一种即用型解决方案，包含 T4 DNA 连接酶、专有连接增强子以及优化的反应缓冲液。

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育：在 50 μl 反应体积中加入 1X Ligation Master Mix 和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1X Ligation Master Mix 和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入 1X Ligation Master Mix 和 1 μg φX174 RF I DNA，并在 37°C 下孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：将 1X Ligation Master Mix 和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。
  4. 转化检测：将 LITMUS 28 载体用 EcoRV（平端）切割，用小牛肠磷酸酶处理并且经凝胶纯化。使用 Ligation Master Mix 实验步骤，将 HaeIII 酶切 φX174 DNA 产生的钝性插入物以 3:1（插入物：载体）的比例连接在载体中。连接产物按之前所述转化。每一批均超过以下标准：

效率（转化物/µg）

重新环化 插入
钝端 > 1 x 107 > 2.5 x 106
未切割的载体 > 1 x 108 N/A

IV. Ligation Enhancer (•)

质量控制检测

  1. 16-Hour Incubation: 50 μl reactions containing 1 μl Ligation Enhancer and 1 μg of HindIII digested Lambda DNA incubated for 16 hours at 37°C results in no detectable non-specific nuclease degradation as determined by agarose gel electrophoresis. 50 μl reactions containing 1 μl NEBNext 5' SR Adaptor 3 and 1 μg of T3 DNA incubated for 16 hours at 37°C results in no detectable non-specific nuclease degradation as determined by agarose gel electrophoresis.
  2. 核酸内切酶活性：在 4 μl 反应体积中加入 1 μl Ligation Enhancer 和 1 μg φX174 RF I 超螺旋 DNA，并在 37°C 下孵育 50 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II（带切口的分子）的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：在 10 μl 反应体积中加入 1 μl Ligation Enhancer 和 40 ng RNA 转录物，并在 37°C 下孵育 16 小时，经凝胶电泳确定没有可检测的 RNA 降解。
  4. 磷酸酶活性：在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中加入 1 μl Ligation Enhancer，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。

V. Q5 PCR Master Mix (2X) (•)

说明
Q5 PCR Master Mix (2X) 经专门优化用于可靠、高精度扩增下一代测序分析 (NGS) 文库，无论 GC 含量如何。主混合物的聚合酶组分 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 是一种新型的 DNA 耐热聚合酶，它具有 3´→5´ 核酸外切酶活性，可融合至一个持续合成能力增强的 Sso7d 结构域。Q5 的错误率也超低（比 Taq DNA 聚合酶的错误率要低 100 倍以上，比强烈火球菌 (Pfu) DNA 聚合酶要低大约 12 倍）。主混合物的缓冲液组分经优化可用于实现可靠扩增，即便是含有 GC 富集的扩增子的情况，并且对各种用于典型 NGS 工作流程的珠子具有更高的适用性。这些功能使得 Q5 PCR Master Mix 理想用于 NGS 文库构建。这种便利的 2X 主混合物包含 dNTPs、Mg++ 以及专有缓冲液，并且仅需添加引物和 DNA 模板即可进行可靠扩增。内含热启动适配子，可方便进行室温反应设置。

质量控制检测

  1. 16 小时孵育：在 37°C孵育16 小时的 50 μl 含 Q5 PCR Master Mix 和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA的反应未产生可检出的非特异性核酸酶降解，如通过琼脂糖凝胶电泳所确定。在 37°C孵育16小时的 50 μl 含 Q5 PCR Master Mix 和 1 μg T3 DNA 的反应未产生可检出的非特异性核酸酶降解，如通过琼脂糖凝胶电泳所确定。
  2. 磷酸酶活性：在 37°C 孵育含 2.5 mM 磷酸对硝基苯的蛋白质磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺，pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）的 Q5 PCR Master Mix 4 小时，未产生可检出的的对硝基苯阴离子，如通过 405 nm 处分光光度计分析所确定。
  3. 功能活性（多重 PCR，磁珠抑制）：在含有 0.5 μM 4-plex 引物混合物和 1X Q5 PCR Master Mix 的 50 μl 反应中使用和不使用羧化磁珠时 20 ng 基因组 DNA 的 30 次 PCR 扩增循环产生四个预期的扩增子且在磁珠存在时不抑制扩增。

发布​时间 2017 年 11 月

修订时间 2023 年 1 月

实验步骤编号：1624

实验步骤编号：2804

产品说明

下一代测序分析 (NG-seq) 是一种可以在染色质免疫沉淀 (ChIP) 及核酸酶靶向切割和释放 (CUT&RUN) 测定法下游用来跨整个基因组鉴定并定量靶标 DNA 富集情况的高通量方法。DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) 含有从 ChIP 或 CUT&RUN DNA 生成高质量 DNA 测序库供 Illumina Systems 平台上下一代测序分析所需的所有酶和缓冲液。快速、人性化的工作流程可最大程度地缩短产生和纯化 DNA 库的亲自动手时间。本产品必须联合 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 使用。

本产品提供数量足以进行 24 次反应的试剂，并且兼容于酶解片段化或超声处理片段化、ChIP 富集的 DNA。为来自 ChIP 和 UT&RUN DNA 的 DNA 文库制备物提供不同的实验步骤。本产品兼容于 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003、SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383 和 CUT&RUN Assay Kit #86652。该产品不适合 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002 和 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004，因为琼脂糖微珠会封阻经超声处理的鲑鱼精 DNA，这会污染 DNA 库制备和 NG-seq。

特异性/灵敏度

已经联合 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 验证该试剂盒使用少至 0.5 ng ChIP DNA 或少至 0.1 ng CUT&RUN DNA 作为起始材料生成合格的 DNA 文库。

物种反应性：

预期的所有物种

背景

染色质免疫沉淀 (ChIP) 测定法是一种用于在细胞天然染色质背景下探测蛋白质-DNA 相互作用的强大的通用技术 (1,2)。这种测定法用于检测与基因组某个特定区域有关的多种蛋白，或相反，用于检测某种特殊蛋白结合的基因组的多个区域 (3-6)。它可用于确定各种蛋白被募集到某个基因启动子上的特定顺序，或用于“测定”整个基因位点上某种特定组蛋白修饰的相对数量 (3,4)。除了组蛋白外，ChIP 测定法还可用于分析转录因子与辅助因子、DNA 复制因子和 DNA 修复蛋白的结合。进行 ChIP 检测时，细胞或组织首先用甲醛固定，甲醛是一种可逆的蛋白-DNA 交联剂，可“维持”细胞中发生的蛋白-DNA 相互作用 (1,2)。细胞进行裂解，染色质采集后使用超声处理或酶消化法进行碎裂。染色质随后使用对某种特殊蛋白或组蛋白修饰具有特异性的抗体进行免疫沉淀。任何与目标蛋白或组蛋白修饰有关的 DNA 序列都会作为交联染色质复合体的一部分进行共沉淀，并且该 DNA 序列的相对数量会在免疫选择过程中达到富集。免疫沉淀后，蛋白质-DNA 交联被逆转，DNA 得以纯化。标准 PCR 或定量实时 PCR 用于测量通过蛋白特异性免疫沉淀达到富集的某种特定 DNA 序列的数量 (1,2)。或者，ChIP 测定法还可与基因组微芯片（芯片上的 ChIP）技术、高通测序或克隆策略联合使用，它们都能对蛋白-DNA 相互作用和组蛋白修饰进行全基因组分析 (5-8)。

有限使用

除非如以 CST 合法授权代表签署的书面形式另行明确同意，否则以下条款适用于 CST、其附属公司或其分销商提供的产品。除非 CST 合法授权代表以书面形式单独接受，否则任何附加于或异于此处所载条款和条件的客户条款和条件均被拒绝且无效。

产品用“仅供研究使用”或类似标示声明标示，并且尚未经 FDA 或其他国外或国内监管实体出于任何目的批准、准许或许可。客户不得出于任何诊断或治疗目的或以任何与产品标示声明相冲突的方式使用任何产品。CST 销售或许可的产品提供给作为最终用户的客户，且仅用于研究和开发用途。出于诊断、预防或治疗目的任何产品使用或出于转售（单独或作为成分）或其他商业目的的任何产品购买都要求来自 CST 的单独许可。客户 (a) 不得向任何第三方出售、许可、出借、捐赠或另行转让或提供任何本公司产品，无论单独或联合其他材料方式，或使用本公司产品制造任何商业产品，(b) 不得复制、修改、逆向工程、反编译、反汇编或另行尝试发现本公司产品的底层结构或技术，或出于开发与 CST 产品或服务竞争的任何产品或服务的目的使用本公司产品，(c) 不得从本公司产品改变或移除任何商标、商品名称、徽标、专利或版权声明或标记，(d) 仅应根据 CST 产品销售条款和任何适用文档使用本公司产品，以及 (e) 应就客户联系本公司产品所用的任何第三方产品或服务而言遵守任何许可、服务条款或类似协议。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。
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