FastScan^™ Phospho-SMAD2 (Ser465/467) ELISA Kit #86932

FastScan™ ELISA 实验步骤

A. 溶液与试剂

注意：用去离子水/纯净水或等效水配制溶液。
仅配制实验当天所需的足够试剂。

1. FastScan™ ELISA 微孔板条板，96 孔 (#53257)：开封/使用前请将所有微孔板条恢复至室温。应将未使用的微孔板条放回可重复密封且含有干燥剂包的原装袋中并存储于 4°C 下。
2. 1X ELISA 洗涤缓冲液：通过使用去离子水稀释 ELISA 洗涤缓冲液 (20X)（每个试剂盒中均有提供）至 1X 来配制。
3. 1X 细胞提取缓冲液：通过使用去离子水稀释 FastScan™ ELISA 细胞提取缓冲液 (5X) #69905 和 FastScan™ ELISA Cell 细胞提取增强剂溶液 (50X) #25243* 至 1X 来配制。这种缓冲液可保存在 4°C 供短期使用（1 - 2 周）。要配制 10 mL 1X 细胞提取缓冲液，则混合 7.8 mL 去离子水、2 mL FastScan™ ELISA 细胞提取缓冲液 (5X) 和 200 μL FastScan™ ELISA 细胞提取增强剂溶液 (50X)。或者，可以在提取细胞或组织后将增强剂溶液添加到细胞提取缓冲液中。当使用 1X 细胞提取缓冲液作为用于检测的样品稀释剂时，建议在使用前将其平衡至室温。

*重要提示：提供的 FastScan™ ELISA 细胞提取增强剂溶液 (50X) 保存在 4°C 下时可能会产生沉淀。要溶解，则在 37°C 下短暂加热并轻轻混合。FastScan™ ELISA 细胞提取增强剂溶液 (50X) 可保存在室温下，以避免沉淀。

注：1X 细胞提取缓冲液含有磷酸酶抑制剂。应在裂解细胞之前立即将蛋白酶抑制剂加入 1X 细胞提取缓冲液中。还可添加其他磷酸酶抑制剂（例如蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 (100X) #5872，未提供）。

4. FastScan™ ELISA Capture 抗体稀释剂：绿色稀释剂，用于重新配制 Capture 抗体。
5. FastScan™ ELISA HRP 抗体稀释剂：用于重新配制 HRP-偶联抗体 的稀释剂（琥珀色瓶）。避光。
6. 4X Capture 抗体：用 3 mL FastScan™ ELISA Capture 抗体稀释剂（绿色稀释剂）重新配制冻干 Capture 抗体（绿色块状物）。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。为获得最佳结果，请在重新配制抗体后立即使用。未使用的经重新配制的 4X Capture 抗体可在 4°C 下保存长达 4 周，尽管与最新配制的抗体相比可能会存在一些信号丢失。
7. 4X HRP-偶联抗体：用 3 mL FastScan™ ELISA HRP 抗体稀释剂重新配制冻干 HRP-偶联抗体（红色块状物）。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。为获得最佳结果，请在重新配制抗体后立即使用。未使用的经重新配制的 4X HRP-偶联抗体可在 4°C 下避光保存长达 4 周，尽管与最新配制的抗体相比可能会存在一些信号丢失。
8. 抗体混合物：在检测前立即混合等体积经重新配制的 4X Capture 和 4X HRP-偶联抗体并混匀。要配制 6 mL 抗体混合物（足以用于 1 块 96 孔板），则混合 3 mL 4X Capture 抗体与 3 mL 4X HRP-偶联抗体。
9. 阳性对照：复水 1 小瓶冻干的阳性对照（参考产品数据表或小瓶标签来确定试剂盒中包含的阳性对照类型）：
   1. 对于 1 型阳性对照，添加 250 μL 去离子水。
   2. 对于 2 型阳性对照，添加 500 μL 1X 细胞提取缓冲液。
   轻轻地充分混合，在室温下保持 1 分钟，随后按照以下“检测程序”部分中列出的步骤进行操作。建议在复水后立即使用阳性对照，但剩余物质可保存在 -80°C 下（在冷冻/解冻的情况下可能会丢失一些阳性对照信号）。阳性对照作为一种对照试剂提供，而不是作为一种绝对定量方法。

   注意：一定数量的 FastScan™ ELISA 试剂盒不包含阳性对照，请参考数据表上的产品内含试剂表，了解所含试剂列表。如果您对如何产生这些试剂盒的阳性对照需要支持，请联系 CST 技术支持 ([电子邮件受保护])。

10. TMB 底物 (#7004)：使用前请恢复至室温。
11. STOP 溶液 (#7002)：使用前请恢复至室温。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

1. 当培养物达到 80-90% 融合度时，吸出培养基。
2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
3. 去除 PBS 并向每块板（直径为 10 cm）添加 0.5 mL 冰冷的 1X 细胞提取缓冲液（建议按需补充蛋白酶抑制剂和其他磷酸酶抑制剂），并在冰上孵育板 5 分钟。
4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
5. 在冰上超声处理裂解物。
6. 在 4°C 微量离心 5 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

1. 当培养物达到 0.5-1.0 x 10⁶ 个活细胞/ml 时，通过低速离心（约 1200 转/分钟）去除培养基。
2. 用冰冷的 1X PBS 洗涤一次。
3. 从 50 mL 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 mL 1X 细胞提取缓冲液（建议按需补充蛋白酶抑制剂和其他磷酸酶抑制剂）中进行裂解。
4. 在冰上超声处理裂解物。
5. 在 4°C 微量离心 5 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

注：在运行检测之前，请将所有材料和已制备的试剂平衡至室温。

1. 如上（第 A 部分）所述制备所有试剂。
2. 样品应不作稀释或用 1X 细胞提取缓冲液稀释至 2X 蛋白浓度，以便在添加抗体混合物后达到最终的 1X 蛋白浓度。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线，可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型结果。
3. 向对应的孔添加 50 μL 每种样品或阳性对照。
4. 向每孔添加 50μL 抗体混合物。
5. 用提供的密封胶带对板进行密封，并在室温下于设定为 400 rpm（中度振荡）的平板摇床上孵育 1 小时。
6. 轻轻取下胶带并洗涤各孔：
   1. 将平板内容物弃入容器中。
   2. 用 1X ELISA 洗涤缓冲液洗涤 3 次*，每孔每次 200 μL。每次洗涤后，将孔吸干或倒空。倒转平板并用干净的纸巾将其吸干，以便除去每个孔中的残留溶液，但无论何时都不得让孔完全干燥。
   3. 用无绒织物清洁全部孔的底面。

*注：某些 FastScan™ ELISA Kit 可能需要在这个步骤额外洗涤。任何额外洗涤的要求都将在试剂盒数据表的产品“说明”中特别注明。

7. 向每个孔添加 100 μl TMB 底物。用胶带密封并在平板摇床（400 rpm，中度振荡）上于室温下黑暗环境中对平板进行孵育 15 分钟，或者在不振荡的情况下于 37°C 下孵育 10 分钟。
8. 向每个孔添加 100 μL STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意：阳性反应的初始颜色为蓝色，一旦添加 STOP 溶液，就变为黄色。

9. 读取结果：
   1. 目测：在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
   2. 分光光度法测定：用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内，读取在 450 nm 处的吸光度。