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7300
PathScan® Phospho-Stat3 (Tyr705) Sandwich ELISA Kit
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PathScan® Phospho-Stat3 (Tyr705) Sandwich ELISA Kit #7300

引用 (1)
图 1：HeLa 细胞用 IFN-α 处理会刺激 Stat3 在 Tyr705 位点的磷酸化，使用 PathScan® Phospho-Stat3 (Tyr705) Sandwich ELISA kit #7300 可进行检测，但不影响使用 Stat3 antibody 通过蛋白质印迹分析检测到的 Stat3 总蛋白的水平。OD450 读数如顶部图所示，使用 Phospho-Stat3 (Tyr705) (3E2) Monoclonal Antibody #9138 或 Stat3 antibody 检测到的相应蛋白质印迹如底部图所示。
图 2：经 IFN-α 处理的 HeLa 细胞的裂解物蛋白浓度与使用试剂盒测得的光密度读数之间存在线性关系。HeLa cells (75% confluence) were treated with IFN-alpha (100 ng/ml), and lysed after growth at 37oC for 10 min.
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7300C		 1 个试剂盒（96 次检测）

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支持性数据

反应性 H M R Mk

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种
产品包括 体积 溶液颜色
Stat3 Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
Phospho-Stat3 (Tyr705) Mouse Detection mAb 1 个 绿色（冻干）
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 个 红色（冻干）
Detection Antibody Diluent 11 ml 绿色
HRP Diluent 11 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

产品说明

CST 的 PathScan® Phospho-Stat3 (Tyr705) Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒，能检测内源水平的磷酸化 Stat3 (Tyr705) 蛋白。Stat3 兔单克隆抗体包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后，该包被抗体可捕获非磷酸化和磷酸化 Stat3 蛋白。充分洗涤后，加入 Phospho-Stat3 (Tyr705) 鼠单克隆抗体 来检测捕获的磷酸化 Stat3 蛋白。随后使用 HRP交联的抗鼠抗体识别结合的检测抗体。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的光密度值与磷酸化 Stat3 蛋白的数量成比例。

* 试剂盒中的抗体为针对该试剂盒的定制制剂。

实验步骤

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ELISA 比色法（冻干）

A. 溶液与试剂

注意：用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条：使用前，将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体：以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂（绿色溶液）以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。To make the final working solution, add the 1.0 ml volume of reconstituted Detection Antibody to 10.0 ml of Detection Antibody Diluent in a clean tube and gently mix. 未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *：以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂（红色溶液）以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。To make the final working solution, add the 1.0 ml volume of reconstituted HRP-Linked Antibody to 10.0 ml of HRP Diluent in a clean tube and gently mix. 未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. Detection Antibody Diluent: Green colored diluent for reconstitution and dilution of the detection antibody.
  5. HRP Diluent: Red colored diluent for reconstitution and dilution of the HRP‑Linked Antibody.
  6. 样品稀释剂：蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液：用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液（包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中）来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液：10X 细胞裂解缓冲液 #9803：该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用（1-2 周）。建议：使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. TMB 底物 (#7004)。
  10. STOP 溶液 (#7002)。

*注意：一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS，每块平板（10 cm 直径）添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF，平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时，通过低速离心（约 1200 转/分钟）移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心（约 1200 转/分钟）收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后，掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封，并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂（包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中，蓝色）稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线，可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外，也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔：
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次，每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤时，将平板重重拍在未用过的毛巾上，以便去除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的检测抗体（绿色）（参阅 A 部分，步骤 2）。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序（C 部分，步骤 4）。
  7. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的 HRP 标记二抗（红色）（参阅 A 部分，步骤 3）。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序（C 部分，步骤 4）。
  9. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 10 分钟，或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意：阳性反应的初始颜色为蓝色，一旦添加 STOP 溶液，就变为黄色。

  1. 读取结果。
    1. 目测：在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定：用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内，读取在 450 nm 处的吸光度。

发布​时间 2013 年 11 月

实验步骤编号：204

特异性/灵敏度

CST 的 PathScan® Phospho-Stat3 (Tyr705) Sandwich ELISA Kit 可检测内源水平的磷酸化 Stat3 蛋白。使用该 Sandwich ELISA Kit #7300 在经 IFN-α 处理的 HeLa 细胞中可检测到显著诱导的磷酸化 Stat3。但蛋白质印迹分析表明 Stat3 总蛋白的水平不变（图 1）。经内部测试确定，该试剂盒可检测规定物种中的蛋白，但也可能检测其他物种的同源蛋白。

背景

Stat3 转录因子是众多细胞因子和生长因子受体的重要信号转导 (1)，对胎鼠发育必不可少 (2)。研究显示 Stat3 在多种人类肿瘤中持续激活 (3,4) ，并有致癌的潜在可能性 (5)，具有抗凋亡活性 (3)。Stat3 通过 Tyr705 位点的磷酸化而激活，从而诱导二聚化、核转位、DNA 结合 (6,7)。转录激活似乎受到 MAPK 或 mTOR 通路介导的 Ser727 位点磷酸化的调控 (8,9)。Stat3 同工型的表达反应了生物学功能，Stat3α (86 kDa) 和 Stat3β (79 kDa) 相对表达水平，依赖于细胞类型、配体暴露或者细胞发育的成熟阶段 (10) 。值得注意的是，Stat3β 蛋白在羧基末端转录激活结构域缺少丝氨酸磷酸化位点 (8)。

通路

探索与本品相关的通路。

有限使用

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