SARS-CoV-2 Spike Protein Serological IgG ELISA Kit #20154

SARS-CoV-2 Spike Protein Serological IgG ELISA 实验步骤

此 ELISA 试剂盒仅供研究使用。不得用于诊断或临床流程。

A. 溶液与试剂

注意：用去离子水/纯净水或等效水配制溶液。仅配制实验当天所需的足够试剂。

1. 刺突蛋白包被的微孔 II：在打开袋子/使用之前，将其全部恢复至室温。应将未使用的微孔板条放回可重复密封且含有干燥剂包的原装袋中并存储于 4°C 下。
2. 1X ELISA 洗涤缓冲液：通过使用去离子水稀释 ELISA 洗涤缓冲液 (20X)（每个试剂盒中均有提供）至 1X 来配制。
3. 样品稀释剂 A：提供的稀释剂用于稀释样品以及复溶试剂盒中包括的阳性和阴性对照。
4. HRP 稀释剂：红色稀释剂用于重新配制和稀释抗人 IgG、HRP-Linked Antibody（提供 11 ml）。
5. 抗人 IgG、HRP-Linked Antibody（ELISA Formulated）：以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 mL HRP 稀释剂（红色溶液）以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。如需配制最终使用溶液，则在一根干净试管中添加满 1.0 mL 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 mL HRP 稀释剂中，轻轻混合。为获得最佳结果，立即使用此工作液。未使用的工作液可能在 4°C 下储存最多 4 周，但与新制溶液相比可能会有一些信号损失。
6. 阳性对照：用 1.0 mL 样品稀释液 A 复溶冻干的阳性对照小瓶。轻轻充分混合，在室温下保持 1 分钟，然后按照“检测程序”部分中所述的步骤进行操作。建议在复溶后立即使用阳性对照，但剩余物质可保存在 -80°C 下（在冻融的情况下可能会丢失一些阳性对照信号）。阳性对照作为一种对照试剂提供，而不是作为一种绝对定量方法。
7. 阴性对照：用 1.0 mL 样品稀释液 A 复溶冻干的阴性对照小瓶。轻轻充分混合，在室温下保持 1 分钟，然后按照“检测程序”部分中所述的步骤进行操作。建议在复溶后立即使用阴性对照，但剩余物质可保存在 -80°C 下（在冻融的情况下可能会丢失一些阴性对照信号）。
8. TMB 底物 (#7004)：使用前请恢复至室温。
9. STOP 溶液 (#7002)：使用前请恢复至室温。

B. 检测程序

注：在运行检测之前，请将所有材料和已制备的试剂平衡至室温。

1. 如上（第 A 部分）所述制备所有试剂。
2. 人来源的样品应按照认可的安全规范进行处理。样品应使用样品稀释剂 A 至少以 1:800 稀释，如果用户需要相对定量，可以进一步进行系列稀释。在复溶后不需要稀释阳性和阴性对照。请参阅数据表，该数据表显示了从阳性对照、阴性对照、未感染个体的血清和 SARS-CoV-2 患者的血清观察到的典型结果。当使用以下所述的临界标准来确定样品是否为抗 CoV-2 刺突蛋白抗体阳性时，必须将 1:800 稀释的样品与未稀释的阴性对照进行比较。

   注意：样品的储存/处理（包括样品的热灭活）可能会影响观察到的信号。因此，强烈建议除了试剂盒中包含的阳性和阴性对照外，用户在运行分析时还应包括自己的阴性和阳性患者样品作为对照，以建立适当的临界值

3. 将 100μL 每个稀释的样品、阳性对照、阴性对照和空白（仅样品稀释液 A）添加到适当的孔中。用提供的密封胶带密封板并在 37°C 下孵育 1 小时。
4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔：
   1. 将平板内容物弃入容器中。
   2. 用 1X ELISA 洗涤缓冲液洗涤 4 次，每孔每次 200 µl。每次洗涤后，将孔吸干或倒空。倒转平板并用干净的纸巾将其吸干，以便除去每个孔中的残留溶液，但无论何时都不得让孔完全干燥。
   3. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
5. 添加 100 μl 复溶抗人 IgG、HRP-linked Antibody (ELISA Formulated)。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
6. 重复洗涤程序（B 部分，步骤 4）。
7. 向每个孔添加 100 μl TMB 底物。用胶带密封，平板在黑暗处 37°C 下孵育 10 分钟。
8. 向每个孔添加 100 μL STOP 溶液。温和振摇数秒。

   注意：阳性反应的初始颜色为蓝色，一旦添加 STOP 溶液，就变为黄色。

9. 读取结果：
   1. 目测：在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
   2. 分光光度法测定：用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内，读取在 450 nm 处的吸光度。
10. 数据分析：
    1. 从阳性和阴性样品对照值中减去“空白”孔（仅样品稀释液 A）的吸光度 450 nm 值。
    2. 阳性对照值应大于 1.5，阴性对照值应小于 0.75。
    3. 如果样品（1:800 稀释）大于 4.1 x 阴性对照吸光度 450 nm 值，则视为阳性。
    4. 如果样品（1:800 稀释）小于 3 x 阴性对照吸光度 450 nm 值，则视为阴性。
    5. 如果样品 (1:800) 大于 3 x 阴性对照吸光度 450 nm 值且小于 4.1 x 阴性对照吸光度 450 nm 值，则认为结果不确定。
    6. 局限性：通过测定一组确认的 SARS-CoV-2 阳性样品和在 SARS-CoV-2 大流行之前收集的未感染的供体血清来确定实验临界值。研究人员可以使用其他样品建立或修改此临界值。该测定的阳性或阴性结果不应成为确定样品感染状况的唯一依据。由于以下原因，SARS-CoV-2 患者样品中可能出现阴性结果：
       • 样品处理/储存不当
       • 感染后样品收集时间
       • 免疫功能受损的患者