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69930
PathScan® RP Total LRRK2 Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒
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PathScan® RP Total LRRK2 Sandwich ELISA Kit #69930

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图 1. PathScan® RP Total LRRK2 Sandwich ELISA Kit #69930 检出来自 A549 细胞、ACHN 细胞、空载转染的 293T 细胞、野生型人 LRRK2 转染的 293T 细胞、MEF 细胞、C2C12 细胞和 PC-12 细胞的提取物中不定水平的 LRRK2 蛋白。上图中显示使用 PathScan® RP Total LRRK2 Sandwich ELISA Kit #69930 时，一组细胞提取物（每份样品为 0.4 mg/mL）的 450 nm 处吸光度。使用 LRRK2 抗体检测的相应蛋白印迹如下图所示。
图 2. 在转染表达人 LRRK2 的表达载体的 293T 细胞中，LRRK2 的表达水平较高。图中显示来自空载转染细胞和经编码人 LRRK2 的表达构建体转染的细胞中裂解物蛋白质浓度与使用 PathScan® RP Total LRRK2 Sandwich ELISA Kit #69930 时 450 nm 处吸光度之间的关系。293T 细胞转染表达野生型人 LRRK2 的表达载体，或转染空载，随后进行裂解。
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69930C		 1 个试剂盒（96 次检测）

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支持性数据

反应性 H M

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种
产品包括 体积 溶液颜色
LRRK2 Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
LRRK2 Mouse Detection mAb 1 个 红色（冻干）
HRP Diluent 5.5 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

产品说明

快速实验步骤 (RP) 的 PathScan® RP Total LRRK2 Sandwich ELISA Kit 是一种在 1.5 小时的缩短分析时间内检出内源水平 LRRK2 蛋白的固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 。在包被微孔板上孵育细胞裂解物并检测抗体后，只需一步即可与 LRRK2 形成夹心结构。随后深度洗涤平板，并添加 TMB 试剂来产生信号。该显色色原的吸光度值与 LRRK2 的数量成比例。点击此处，以详细了解您的所有 ELISA 试剂盒选项。

*试剂盒中的抗体为专属该试剂盒的定制制剂。

实验步骤

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PathScan® 夹心式 ELISA 实验步骤（快速实验步骤）

注：此实验步骤用于使用直接与检测用抗体偶联的 HRP 的 PathScan® 试剂盒（快速实验步骤），而不用于依次添加检测用抗体和 HRP 二抗的两步法。

A. 溶液与试剂

注意：用去离子水/纯净水或等效水制备溶液。

  1. 微孔板条板：在打开袋子/使用之前，请将其全部恢复至室温。应将未使用的微孔板条放回可重复密封且含有干燥剂包的原装袋中并存储于 4°C 下。
  2. Detection Antibody: Reconstitute lyophilized Detection Antibody (red colored cake) with 1 mL of HRP Diluent (red solution) to yield a concentrated stock solution. 在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。To make the final working solution, add the full 1 mL of reconstituted Detection Antibody to 4.5 mL of HRP Diluent in a clean tube and gently mix. 为获得最佳结果，请在重新配制抗体后立即使用。未使用的经重新配制的检测抗体可在 4°C 下保存长达 4 周，尽管与最新配制的抗体相比可能会存在一些信号丢失。
  3. HRP 稀释剂：红色稀释剂用于用于重组和稀释与 HRP 相关的检测抗体。
  4. 1X ELISA 洗涤缓冲液：通过用去离子水将 ELISA Wash Buffer (20X)（每个试剂盒中均有提供）稀释至 1X 来制备。
  5. 1X 细胞裂解缓冲液：通过用去离子水将 10X Cell Lysis Buffer #9803 稀释至 1X 来制备。这种缓冲液可以贮存在 4°C 供短期使用（1–2 周）。建议：用于制备细胞裂解物时，在使用前立即添加 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail（#5872，未提供）和 1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF，#8553，未提供）。
  6. TMB 底物 (#7004)：使用前请恢复至室温。
  7. STOP 溶液 (#7002)：使用前请恢复至室温。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS，每块平板（10 cm 直径）添加 0.5 mL 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液（含 1 mM PMSF 和 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail），平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 下微量离心（14,000 rpm）10 分钟，随后将上清液转移到一根新的试管中。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/mL 时，通过低速离心（约 1200 rpm）移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心（约 1200 rpm）收集细胞，并用 5-10 mL 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 mL 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 mL 1X 细胞裂解缓冲液（含 1 mM PMSF 和 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail）中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 下微量离心（14,000 rpm）10 分钟，随后将上清液转移到一根新的试管中。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

注：在运行检测之前，请将所有材料和已制备的试剂平衡至室温。

  1. 如上（第 A 部分）所述制备所有试剂。
  2. 样品应不作稀释或用 1X 细胞裂解缓冲液稀释至 2X 蛋白浓度，以便在添加检测抗体后达到最终的 1X 蛋白浓度。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线，可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型结果。
  3. 向对应的孔添加 50 μL 每种样品。
  4. 向每个孔中添加 50 µL 检测抗体。
  5. 对平板进行密封，并在室温下于设定为 400 rpm（中度振荡）的平板摇床上孵育 1 小时。
  6. 轻轻取下胶带并洗涤各孔：
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次，每孔每次 200 µL。
    3. 每次洗涤时，将平板重重拍在未用过的毛巾上，以便去除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  7. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封并在平板摇床（400 rpm，中度振荡）上于室温下黑暗环境中对平板进行孵育 15 分钟，或者在不振荡的情况下于 37°C 下孵育 10 分钟。
  8. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

    9. 注意：阳性反应的初始颜色为蓝色，一旦添加 STOP 溶液，就变为黄色。

  9. 读取结果：
    1. 目测：在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定：用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内，读取在 450 nm 处的吸光度。

创建于 2020 年 7 月

实验步骤编号：2144

特异性/灵敏度

PathScan® RP Total LRRK2 Sandwich ELISA Kit 检出内源水平的 LRRK2。该试剂盒的敏感度如图 2 所示。经内部测试确定，该试剂盒可检测规定物种中的蛋白，但也可能检测其他物种的同源蛋白。

背景

仅次于阿尔茨海默病的第二常见的神经退行性疾病，帕金森病 (PD) 是一种以僵硬，震颤和姿势不稳为特征的进行性运动障碍。PD 的病理特点是腹侧中脑黑质中的多巴胺能神经元逐渐丧失，并且脑干存活神经元中存在细胞内 Lewy 小体（α-突触核蛋白、泛素和其他组分的蛋白质聚集体）(1)。研究表明，不同的基因及基因位点在遗传上与 PD 相关，其中包括 α-synuclein/PARK1 和 4、parkin/PARK2、UCH-L1/PARK5、PINK1/PARK6、DJ-1/PARK7、LRRK2/PARK8、synphilin-1 和 NR4A2 (2)。
富亮氨酸重复激酶2 (LRRK2) 包含氨基末端亮氨酸重复序列 (LRR)、一个 Ras 样小 GTP 结合蛋白样 (ROC) 结构域，一个 MLK 蛋白激酶域和一个羧基末端 WD40 重复结构域。研究表明，至少 20 个 LRRK2 基因突变与 PD 有关，其中 G2019S 突变最普遍 (3)。G2019S 突变导致 LRRK2激酶活性提高，从而诱导神经突长度逐步减小，导致进行性神经突丧失和神经元存活降低 (4)。研究人员目前正在 PD 临床试验中测试 MLK 抑制剂 CEP-1347，结果表明 LRRK2 具有作为 PD 治疗靶标的潜在价值 (5)。

有限使用

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