PathScan^® Total Oct-4A Sandwich ELISA Kit #9539

ELISA 比色

注意：请参阅产品专用数据表或产品网页，以了解检测的孵育温度。

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要配制 1 L PBS：添加 50 ml 10X PBS 到 950 ml dH₂O 中，混匀。
2. 使用前，让全部微孔板条达到室温。
3. 用 dH₂O 稀释 20X Wash Buffer（每个 PathScan^® Sandwich ELISA Kit 中均包括）来配制 1X Wash Buffer。

4. 1X 细胞裂解缓冲液：10X 细胞裂解缓冲液 (#9803)：要配制 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液，则添加 10X 细胞裂解缓冲液到 9 ml dH₂O 中，混匀。这种缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用（1-2 周）。

   建议：使用前，立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF) (#8553)。

   注意：请参阅产品专用数据表或网页，以了解裂解缓冲液建议。

5. TMB 底物：(#7004)。
6. STOP Solution：(#7002)。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
3. 去除 PBS，每块平板（10 cm 直径）添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
5. 在冰上超声处理裂解物。
6. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

对于悬浮细胞

1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 10⁶ 个活细胞/ml 时，通过低速离心（约 1,200 转/分钟）移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 通过低速离心（约 1,200 转/分钟）收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
3. 从 50 ml 生长培养基收获的细胞可以在含 1 mM PMSF 的 2.0 ml 1 X 细胞裂解缓冲液中裂解。
4. 在冰上超声处理裂解物。
5. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

C. 检测程序

1. 当微孔板条达到室温后，掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封放置在储存袋中，并立即贮存在 4 °C 的环境中。
2. 细胞裂解物不稀释或用样品稀释剂（每个 PathScan^® Sandwich ELISA Kit 中均提供，蓝色）稀释。每个试剂盒的独立数据表或产品网页中都提供了有关裂解物适宜稀释倍数和试剂盒分析结果的信息。
3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外，也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
4. 温和取下胶带并洗涤各孔：
   1. 将平板内容物弃入容器中。
   2. 用 1 X 洗涤缓冲液洗涤 4 次，每孔每次 200 µl。
   3. 每次洗涤的时候都要将平板拍在未用过的纸巾上，拍击力度要足够大，这样才能清除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让孔处于完全干燥的状态。
   4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
5. 向每个孔中添加 100 µl 检测抗体（绿色）。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 1 小时。
6. 重复洗涤程序（C 部分，步骤 4）。
7. 向每个孔中添加 100 µl HRP-连接的二抗（红色）。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
8. 重复洗涤程序（C 部分，步骤 4）。
9. 每孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 10 分钟，或在 25°C 下孵育 30 分钟。

10. 每孔添加 100 µl STOP 液。温和振摇数秒。

    注意：阳性反应的初始颜色为蓝色，一旦添加 STOP 液，就变为黄色。

11. 读取结果
    1. 目测：在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定：用无绒薄布擦拭各孔底部。在添加 STOP Solution 后 30 分钟内在 450 nm 读取吸光度。