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54905
Histone H3 (K9M Mutant Specific) (E4N7V) Rabbit mAb
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Histone H3 (K9M Mutant Specific) (E4N7V) Rabbit mAb #54905

引用 (1)
筛选器：
  1. IHC
使用 Histone H3 (K9M Mutant Specific) (E4N7V) Rabbit Mab 对石蜡包埋的组蛋白 H3 K9M 突变小鼠小肠（左）或野生型小鼠小肠（右）进行免疫组织化学分析。（组织由 Aaron Huebner 博士提供，马萨诸塞州总医院 Hochedlinger 实验室，波士顿，MA。）
石蜡包埋的 293T 细胞沉淀物免疫组织化学分析，H3F3A 转染（左）或突变 K9M H3F3A 转染（右），使用 Histone H3 (K9M Mutant Specific) (E4N7V) Rabbit Mab。
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54905S		 100 µl

Carrier-Free Bulk & Custom Formulation

支持性数据

反应性 H M
灵敏度 内源性
MW (kDa) 17
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
免疫组织化学（石蜡） 1:400 - 1:1600

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。‭

实验步骤

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免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精（可选）。
  5. 洗涤缓冲液：
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112)。
  7. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢：要制备 100 ml，添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备 4 mL of dH2O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统：SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物：SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂： SignalStain® Mounting Medium (#84583)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤：
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液，并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中，使用前充分混合。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB，并密切观察，通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#84583) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂		 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容的
色原		 SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632 SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824
SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986  
SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644  

注意：使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗，考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​时间 2010 年 2 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：283

特异性/灵敏度

Histone H3 (K9M Mutant Specific) (E4N7V) Rabbit mAb 可检测 K9M 突变型组蛋白 H3.1、H3.2 和 H3.3 蛋白的内源水平。该抗体不会与野生型组蛋白 H3.1、H3.2 或 H3.3 发生交叉反应。

物种反应性：

人, 小鼠

来源/纯化

使用与人组蛋白 H3.3 蛋白的 K9M 突变型序列相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

多个外显子组测序分析揭示了组蛋白 H3 驱动突变在许多不同癌症中的高频率，包括弥漫性内在脑桥神经胶质瘤 (DIPG)、软骨细胞瘤、肉瘤和 HPV 阴性头颈部鳞状细胞癌。既往研究显示，这些癌症中的赖氨酸至蛋氨酸组蛋白突变作为其各自赖氨酸甲基转移酶的强效抑制剂，导致组蛋白甲基化状态的整体改变和基因表达的失调。例如在 DIPG 中，组蛋白 H3 K27M 突变会伴随多梳阻遏复合体 2 (PRC2) 介导的组蛋白 H3 赖氨酸27三甲基化水平大幅度降低、PRC2 在基因组上分布发生改变以及与不同癌症通路有关的基因表达发生变化 (1-3)。在软骨细胞瘤中，组蛋白 H3 K36M 突变抑制 WHSC1 (MMSET) 和 SETD2 组蛋白甲基转移酶的功能导致组蛋白 H3 赖氨酸 36 三甲基化的水平降低以及许多癌症相关基因的失调 (4)。与 H3K27M 和 H3K36M 突变类似，组蛋白 H3 K9M 突变已经证实可抑制 H3K9 定向的组蛋白甲基转移酶 G9a，导致组蛋白 H3 赖氨酸 9 三甲基化的水平降低 (5)。鉴于 G9a 在调节基因表达方面的广泛作用，该 K9M 突变可能也在癌症中发挥作用。

有限使用

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