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6893
HMGB1 (D3E5) Rabbit mAb
一抗
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R
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HMGB1 (D3E5) Rabbit mAb #6893

引用 (141)
筛选器：
  1. WB
  2. IHC
使用 HMGB1 (D3E5) Rabbit mAb，对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹法分析。
使用 HMGB1 (D3E5) Rabbit mAb 对未经处理 (-) 或经 Lipopolysaccharides (LPS) #14011（50 ng/ml，4 小时；+）处理后再用 Nigericin（15 μM，45 分钟；+）处理的小鼠骨髓源性巨噬细胞 (mBMDM) 的培养基提取物进行蛋白印迹法分析。
使用 HMGB1 (D3E5) Rabbit mAb，对石蜡包埋的小鼠肺进行免疫组织化学分析。
使用 HMGB1 (D3E5) Rabbit mAb，对石蜡包埋的人类结肠癌进行免疫组织化学分析。
使用 HMGB1 (D3E5) Rabbit mAb，对石蜡包埋的人类肺癌进行免疫组织化学分析。
使用 HMGB1 (D3E5) Rabbit mAb，对石蜡包埋的人体前列腺癌进行免疫组织化学分析。
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Carrier-Free Bulk & Custom Formulation

支持性数据

反应性 H M R Mk
灵敏度 内源性
MW (kDa) 29
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫组织化学（石蜡） 1:100 - 1:400

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

有关此产品的无载体（无 BSA 和无叠氮化物）版本，请参阅产品 #50438。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹，在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜，同时柔和振摇。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测，进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O，混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ，混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ，混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精（可选）。
  5. 洗涤缓冲液：
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112)。
  7. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢：要制备 100 ml，添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备 4 mL of dH2O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统：SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物：SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂： SignalStain® Mounting Medium (#84583)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤：
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液，并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中，使用前充分混合。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB，并密切观察，通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#84583) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂		 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容的
色原		 SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632 SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824
SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986  
SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644  

注意：使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗，考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​时间 2010 年 2 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：283

特异性/灵敏度

HMGB1 (D3E5) Rabbit mAb 可识别 HMGB1 总蛋白的内源水平。该抗体不会与其他 HMGB 蛋白发生交叉反应，包括 HMGB2 和 HMGB3。

物种反应性：

人, 小鼠, 大鼠, 猴

Species predicted to react based on 100% sequence homology

鸡 , 牛 , 马

来源/纯化

使用与人体 HMGB1 蛋白 Ala137 周围残基相对应的合成肽，对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

高迁移率族蛋白 B1 (HMGB1)，属于包含 HMG 盒结构域的高度保守蛋白家族 (1,2)。所有三个家族成员（HMGB1、HMGB2 和 HMGB3）包含两个 HMG 盒结构域和一个羧基末端酸性结构域。HMGB1 是广泛表达和含量丰富的蛋白质 (2)。HMGB2 在胚胎发育期间广泛表达，但仅限于淋巴器官和成年动物的睾丸中 (3)。HMGB3 仅在胚胎形成期间表达 (4)。尽管表达各异，不同家族成员的生物化学特性可能区别不明显。HMG 盒结构域会促进 HMGB 蛋白与 DNA 的小沟结合，从而导致 DNA 双螺旋的局部弯曲 (1,2)。HMGB 蛋白由位点特异性 DNA 结合蛋白募集，并且有助于促进该结合蛋白装配至染色质中的同族结合位点上。例如，HMGB1 促进 Hox 蛋白、Oct-1、p53）、Rel 蛋白、类固醇激素受体蛋白与靶基因启动子相结合 (1,2)。除了在细胞核中的作用，HMGB 蛋白在与炎症相关的胞外信号转导中发挥重要作用 (5,6)。HMGB1 在细胞坏死期间大量释放至胞外环境中，但在凋亡期间不释放。胞外 HMGB1 通过充当炎症性白血球、平滑肌细胞和干细胞的化学引诱物，作为可溶性和颗粒性抗原的免疫佐剂发挥作用，以及刺激 T 细胞和树突细胞的激活，“警告”先天免疫系统。另外，被激活的单核细胞、巨噬细胞和树突细胞也会分泌 HMGB1，形成引起其他细胞因子和中性粒细胞释放的正反馈循环。已证实低氧会引起 HMGB1 在肝脏中释放，部分研究表明了胞外 HMGB1 在肿瘤内稳态中发挥作用 (5,6)。

有限使用

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