OX40L (D6K7R) Rabbit mAb #59036

免疫组织化学 (Leica^® BOND™)

注：请参阅产品数据表或产品网页，了解合适的抗体稀释度^。

	步骤	试剂	时间/温度
1	脱蜡	BOND™ Dewax Solution、100% 乙醇、BOND™ Wash Solution	预编程的 Leica® BOND™
2	抗原修复	BOND™ Epitope Retrieval ER2 Solution	20 分钟，100˚C | 实验步骤：用 ER2 进行 20 分钟的热诱导表位修复 (HIER)
3	过氧化物封闭液	Refine Detection Kit Peroxide Block*	5 分钟
	洗涤	BOND™ Wash Solution	3x 0:00 分钟
4	蛋白封闭液（可选）	#5425 NGS 或 #15019 Animal-Free Blocking Solution	20 分钟
5	一抗^	用 #8112 SignalStain® Antibody Diluent 稀释	30 分钟
	洗涤	BOND™ Wash Solution	3x 2:00 分钟
不适用	Post Primary Mouse Linker	Refine Detection Kit Post Primary*	不适用
6	二次检测	Refine Detection Kit Polymer*	10 分钟
	洗涤	BOND™ Wash Solution/Deionized Water	定制（参见下文）
7a	可视化	Refine Detection Kit Mixed DAB Refine*	0:00 分钟
7b	可视化	Refine Detection Kit Mixed DAB Refine*	10 分钟
	洗涤	去离子水	3x 0:00 分钟
8	复染	Refine Detection Kit Hematoxylin*	5 分钟
	洗涤	去离子水	0:00 分钟
	洗涤	BOND™ Wash Solution	0:00 分钟
	洗涤	去离子水	0:00 分钟
9	脱水（离线）：
	在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
	在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
	在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
10	用盖玻片和 #84583 SignalStain® Mounting Medium 封片。
	可选订制洗涤：	BOND™ Wash Solution	2:00
		BOND™ Wash Solution	分液器类型：开放式 0:00
		BOND™ Wash Solution	2:00
		BOND™ Wash Solution	分液器类型：开放式 0:00
		BOND™ Wash Solution	0:00
		去离子水	0:00

*BOND™ Polymer Refine Detection Kit（货号：DS9800）中所含的试剂

LEICA^® 是 Leica Microsystems IR GmbH 的注册商标。

BOND™ 是 Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd 的商标。CST 和 Leica Microsystems IR GmbH 或 Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd 之间没有附属或赞助关系。

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 二甲苯。
2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。
3. 去离子水 (dH₂O)。
4. 苏木精（可选）。
5. 洗涤缓冲液：
   1. 含 Tween^® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween^® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH₂0 中并混合。
6. SignalStain^® Antibody Diluent (#8112)。
7. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH₂O 中。
8. 3% 过氧化氢：要制备 100 ml，添加 10 ml 30% H₂O₂ 至 90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备 4 mL of dH₂O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
10. 检测系统：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
11. 底物：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)。
12. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
13. 封片剂： SignalStain^® Mounting Medium (#84583)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
6. 去除封闭液，并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain^® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
7. 使 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
8. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain^® DAB Diluent 中，使用前充分混合。
12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain^® DAB，并密切观察，通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
13. 将切片浸入 dH₂O 中。
14. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
15. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
17. 使用盖玻片和封片剂 (#84583) 封片。

注意：使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗，考虑到检测试剂的不同灵敏度。