p75NTR (D4B3) XP^® Rabbit mAb #8238

蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹，在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween^® 20 中稀释的一抗孵育过夜，同时柔和振摇。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测，进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH₂O，混合。
2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH₂O ，混合。
3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH₂O 稀释至 1X。
4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH₂O ，混合。
5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH₂O 中，并混合。
6. 含有 Tween^® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH₂O 中并混合。
7. 脱脂奶粉：(#9999)。
8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
6. 微量离心机内离心 5 分钟。

7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

   注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用 Protein A agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀，以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS，将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH₂O 中并混合。

2. 10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH₂O，并混合。

   注意：使用前，请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

3. 3X SDS上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
4. Protein A Agarose Beads：(#9863)。
5. 10X 激酶缓冲液（用于激酶试验）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH₂O 中并混合。
6. ATP (10 mM)（用于激酶试验）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。
6. 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清（可选）

1. 涡旋振荡，以混合磁珠。
2. 添加 10–30 µl 的 50% Protein A agarose beads 混悬液至 200 µl 细胞裂解物中 (1 mg/ml)。
3. 在 4°C 下，旋转孵育 30–60 分钟。
4. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
5. 继续以下的免疫沉淀法。

免疫沉淀法

重要提示：强烈建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗，把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗，把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗，把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗，把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配，并与一抗样品同时进行。

1. 将一抗（按产品说明书中推荐的合适稀释比例配制）加入到浓度为 1 mg/ml 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下，旋转孵育过夜。
2. 添加 protein A 琼脂糖（10–30 µl 的 50% 珠浆）。在 4°C 下，旋转孵育 1-3 小时。
3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
3. 对于 SDS-PAGE，将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注意：当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）作为二抗，以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗，以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

免疫荧光法（冰冻）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
3. 封闭缓冲液：（1X PBS / 5% 常规血清/ 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如 Normal Goat Serum (#5425) 添加至 9.5 ml 1X PBS）并充分混合。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
4. 抗体稀释缓冲液： (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。

5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗：

   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8889
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414

   注意：首次使用一抗或荧光物质标记的二抗时，用滴定法检测抗体，以确定哪种稀释度会在最低的背景下为您的样品产生最强的特定信号。

6. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 样品制备 - 冰冻/恒冷箱切片 (IF-F)

1. 冰冻固定组织进行免疫染色（C 部分）。
2. 对新鲜未固定的冰冻组织，请立刻按下列步骤固定：

   1. 切片用 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛浸没。

      注意：甲醛有毒性，仅可在通风橱中使用。

   2. 室温下固定切片 15 分钟。
   3. 吸干液体后用 1X PBS 冲洗三次，每次 5 分钟。
   4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭标本时，按照产品网页实验步骤中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
8. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong^® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

免疫荧光法（免疫细胞化学法）实验步骤

A. 溶液与试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
3. 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 20X PBS、1.25 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（如 Normal Goat Serum (#5425)）和 9.0 mL dH₂O，然后充分混匀。
4. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA)：添加 0.1 g BSA (9998) 至 10 ml 1X PBS 中，然后充分混匀。

5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗：

   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8889
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414
6. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。
   注意：甲醛有毒性，仅可在通风橱中使用
2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
4. 4°C 温度下孵育过夜。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
6. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
7. 按步骤 5 使用 1X PBS 漂洗。
8. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong^® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
9. 为达到最佳效果，应立即采用适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

非偶联兔抗体的流式细胞术（活细胞）实验步骤

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：若要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水，混合。
2. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。
3. 建议使用抗兔二抗：
   • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
   • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8889
   • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414
   • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (PE Conjugate) #79408

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活力指示染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品网页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

注：如果使用全血，则需裂解红血细胞，并在免疫染色之前通过离心分离洗涤。

注：人 Fc 受体与兔 IgG 发生交叉反应。当感兴趣的细胞表达高水平的 Fc 受体蛋白（例如，巨噬细胞/单核细胞谱系）时，在用兔抗体进行免疫染色之前，用人 Fc 块预孵育活细胞。

注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次测定 5 x 10⁵ 至 1 x 10⁶ 个细胞。）
2. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
4. 在冰上孵育 30 分钟至 1 小时。避光。
5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗（按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
7. 在冰上孵育 30 分钟。避光。
8. 用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。弃去上清液。重复。
9. 在 200-500 μl 抗体稀释缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。