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4392
PIAS4 (D2F12) Rabbit mAb
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PIAS4 (D2F12) Rabbit mAb #4392

引用 (19)
筛选器：
  1. WB
使用 PIAS4 (D2F12) Rabbit mAb 对 来自 293 和 CCRF-CEM 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
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4392T		 20 µl
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Carrier-Free Bulk & Custom Formulation

支持性数据

反应性 H R Mk
灵敏度 内源性
MW (kDa) 75
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹，在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜，同时柔和振摇。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测，进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O，混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ，混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ，混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

特异性/灵敏度

PIAS4 (D2F12) Rabbit mAb 可检测内源水平的PIAS4 总蛋白。

物种反应性：

人, 大鼠, 猴

Species predicted to react based on 100% sequence homology

小鼠

来源/纯化

使用与人 PIAS4 蛋白中 Lys59 周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

活化 Stat 的蛋白抑制物 (PIAS) 包括 PIAS1、PIAS3、PIASx 和 PIASy，最初根据它们与转录因子 Stat 家族的相互作用被描述 (1,2)。PIAS1、PIAS3 和 PIASx 分别结合并抑制 Stat1、Stat3 和 Stat4 (1-3)。PIAS1 缺失会抑制干扰素诱导的基因并增强抗感染保护 (4)。PIAS 家族包含一个保守的环状结构域，该结构域作为小泛素相关修饰 (SUMO) 连接酶的发挥作用，可偶联 SUMO 接合酶 Ubc9 及其底物蛋白 (5,6)。如今，大量研究表明，PIAS 家族成员能够通过不同机制调节转录因子的活性，包括 NF-κB (7,8)、c-Jun、p53 (5,9)、Oct-4 (10) 和 Smads (11,12)。PIAS1 活性通过磷酸化和精氨酸甲基化调节。炎症刺激会诱导 IKK 介导的 PIAS1 Ser90 磷酸化，这是其活性所必需的 (13)。此外，在干扰素处理后，PRMT1 会诱导 PIAS1 Arg303 的精氨酸甲基化，这与其在 Stat1 上的抑制活性有关 (14)。
PIAS4（也称 PIASy）是 Ets-1 的一个特定 SUMO-E3 连接酶，可抑制 Ets-1 依赖的转录 (15)。PIAS4 还会改变核定位，减弱 C/EBPδ 的转录活性并增强细胞增殖和迁移 (16)。

  1. Liu, B. et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 10626-31.
  2. Chung, C.D. et al. (1997) Science 278, 1803-5.
  3. Arora, T. et al. (2003) J Biol Chem 278, 21327-30.
  4. Liu, B. et al. (2004) Nat Immunol 5, 891-8.
  5. Schmidt, D. and Müller, S. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99, 2872-7.
  6. Kotaja, N. et al. (2002) Mol Cell Biol 22, 5222-34.
  7. Liu, B. et al. (2005) Mol Cell Biol 25, 1113-23.
  8. Tahk, S. et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104, 11643-8.
  9. Bischof, O. et al. (2006) Mol Cell 22, 783-94.
  10. Tolkunova, E. et al. (2007) J Mol Biol 374, 1200-12.
  11. Long, J. et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101, 99-104.
  12. Murdoch, R.N. and Edwards, T. (1992) Biochem Int 28, 1029-37.
  13. Liu, B. et al. (2007) Cell 129, 903-14.
  14. Weber, S. et al. (2009) Genes Dev 23, 118-32.
  15. Nishida, T. et al. (2007) Biochem J 405, 481-8.
  16. Zhou, S. et al. (2008) J Biol Chem 283, 20137-48.

通路

探索与本品相关的通路。

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