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52113
SOCS3 (D6E1T) Rabbit mAb
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SOCS3 (D6E1T) Rabbit mAb #52113

引用 (28)
筛选器：
  1. WB
使用 SOCS3 (D6E1T) 兔单克隆抗体（上图）或 β-肌动蛋白 (D6A8) 兔单克隆抗体#8457（下图）对未经 (-) 或已经 Human Oncostatin M #5367（hOSM；20 ng/ml，1 小时；+）处理的 Hep G2 和 A-375 细胞系的提取物进行蛋白印迹分析。
使用 SOCS3 (D6E1T) 兔单克隆抗体对转染空载 (-) 或转染表达全长人 SOCS3 (+) 的表达载体的 293T 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。
使用 SOCS3 (D6E1T) 兔单克隆抗体（上图）或 β-肌动蛋白 (D6A8) 兔单克隆抗体（下图）对未经 (-) 或已经 Jak3 抑制剂 WHI-P154（40 μM，过夜；+）处理的 KARPAS-299 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。KARPAS 细胞系来源：剑桥大学 Abraham Karpas 博士。
使用 SOCS3 (D6E1T) 兔单克隆抗体（上图）或 GAPDH (D16H11) XP® 兔单克隆抗体#5174（下图）对未经 (-) 或已经 Lipopolysaccharides #14011（LPS；50 ng/ml，4 小时；+）处理的小鼠骨髓源性巨噬细胞 (mBMDM) 的细胞提取物进行蛋白印迹分析。
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Carrier-Free Bulk & Custom Formulation

支持性数据

反应性 H M
灵敏度 内源性
MW (kDa) 28
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹，在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜，同时柔和振摇。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测，进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O，混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ，混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ，混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

特异性/灵敏度

SOCS3 (D6E1T) 兔单克隆抗体可检测 SOCS3 总蛋白的内源水平。

物种反应性：

人, 小鼠

来源/纯化

使用对人 SOCS3 蛋白具有特异性的重组蛋白对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

细胞因子信号抑制因子 (SOCS) 家族成员能负调控细胞因子信号转导且可抑制 Jak/Stat信号通路 (1-3)。SOCS 家族至少由 8 个成员组成，包括最初发现的由细胞因子诱导含有SH2的蛋白(CIS1)，以及 SOCS1-7。每个 SOCS 家族成员包含一个 SH2 中心域和称为 SOCS 盒的保守羧基末端基序。这些蛋白是细胞因子信号转导、增殖、分化和免疫应答的重要调节物。
SOCS3 在肺、脾和胸腺细胞中的水平较低，与其他 SOCS 家族成员一样，白介素、EPO、IFN-γ、CSF 和 TNF-α 等许多因子均会快速诱导它的表达 (4)。SOCS3 使用其 SH2 结构域来结合激活的 Jaks 及其同源受体，以产生负反馈抑制。除了最初报道的 SOCS3 表达诱导剂,外，后续研究介绍了 SOCS3 所介导的负向反馈抑制，包括瘦素 (5)、生长激素 (6)、趋化因子受体 (7)、胰岛素 (8) 与某些病原 (9,10)。SOCS3 缺失可导致伴随胎盘功能不全的胚胎致死 (11)。SOCS3 信号转导与过敏反应 (12)、炎症疾病 (13)、内毒素休克 (14)、创伤修复 (15)以及肥胖(16,17) 也有病理性关联。

  1. Alexander, W.S. et al. (1999) J Leukoc Biol 66, 588-92.
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  17. Howard, J.K. et al. (2004) Nat Med 10, 734-8.

通路

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KARPAS 细胞系来源：剑桥大学 Abraham Karpas 博士。
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