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99567
TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb
一抗
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R
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TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb #99567

引用 (12)
筛选器：
  1. WB
  2. IHC
  3. IF
使用 TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb（上图）和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457 （下图）对人 CD8+ T 细胞以及不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。
使用 TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的 293T 细胞沉淀物、对照物（左上图）或 TIGIT 转染物（右上图），MJ [G11] 细胞沉淀物（左下图，阳性）和纯化的 CD8+ 人外周血单核细胞沉淀物（右下图，阳性）进行免疫组织化学分析。使用人血纯化 CD8+ T 细胞，并使用存在human interleukin-2 (hIL-2) #8907 (7 ng/ml) 的 CD3 和 CD28 抗体涂层球刺激 7 天。
使用 TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人尿路上皮癌进行免疫组织化学分析。
使用 TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人结肠腺癌进行免疫组织化学分析。
使用 TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人食管癌进行免疫组织化学分析。
使用 TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人鳞状细胞癌进行免疫组织化学分析。
使用 TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人非小细胞肺癌进行免疫组织化学分析。
以浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（右图）作为对照，使用 TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb（左图）对石蜡包埋的人 B 细胞非霍奇金淋巴瘤进行免疫组织化学分析。
使用 TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人前列腺癌进行免疫组织化学分析。
使用 TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人扁桃体进行免疫组织化学分析。
使用 TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb（绿色）和 CD8α (RPA-T8) Mouse mAb (FITC Conjugate) #55397（伪彩红色）对人 CD8+ T 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。样本用 ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961（蓝色）封片。使用人血纯化 CD8+ T 细胞，并使用存在human interleukin-2 (hIL-2) #8907 (20 ng/ml) 的 CD3 和 CD28 抗体涂层球刺激 7 天。
使用 TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb（绿色）对 MJ [G11] 细胞（左图，阳性）和 IGROV-1 细胞（右图，阴性）进行共聚焦免疫荧光分析。样本用 ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961（蓝色）封片。
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Carrier-Free Bulk & Custom Formulation

支持性数据

反应性 H
灵敏度 内源性
MW (kDa) 18、30-40
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:2000
免疫组织化学（石蜡） 1:200 - 1:800
免疫荧光法（免疫细胞化学） 1:800 - 1:3200

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。‭

有关此产品的无载体（无 BSA 和无叠氮化物）版本，请参阅产品 #17046。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育，同时轻轻晃动。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O，混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ，混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ，混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液：含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 20 ml，将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  12. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
  13. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  15. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）一起孵育，并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后，再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：263

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精（可选）。
  5. 洗涤缓冲液：
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. 1X Phosphate Buffered Saline with Tween® 20 Antibody Diluent: To prepare 5 mL of 1X PBST, dilute 250 µl of Phosphate Buffered Saline with Tween® 20 (PBST-20X) (#9809) with 5 mL dH2O.
  7. 1X EDTA 修复液：要制备 250 mL 的 1X EDTA 修复液，使用 225 mL 的 dH2O 稀释 25 ml 的 SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14746)。
  8. 3% 过氧化氢：要制备 100 ml，添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备4 mL 的 dH2O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统：SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物：SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂： SignalStain® Mounting Medium (#84583)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤：
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于 EDTA：将切片浸入 1X EDTA 修复液中，再放入微波炉中加热直到沸腾；继续保持 15分钟的亚沸腾温度 (95°-98°C)。无需冷却。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. Remove blocking solution and add 100–400 µl primary antibody diluted in 1X Phosphate Buffered Saline with Tween® 20 Antibody Diluent (#9809) to each section. 4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中，使用前充分混合。
  12. 在每张切片上加 100–400 µl SignalStain® DAB，并密切观察，通常 5–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#84583) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂		 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容的
色原		 SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632 SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824
SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986  
SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644  

注意：使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗，考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​时间 2023 年 10 月

实验步骤编号：3105

免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： ( #9808) 要配制 1L 1X PBS：添加50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O，然后混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences, Inc.（目录号 18814），新鲜使用并且在 4°C 下的阴暗处存储在敞口小瓶中，且在 1X PBS 中稀释以供使用。
  3. 封闭液（1X PBS/5% 正常血清/0.3% Triton™X-100）：要配制 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如，Normal Goat Serum ( #5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O，然后充分混匀。搅拌的同时，添加 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS/0.3% Triton X-100)：要配制 10 ml，添加30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS。混匀。
  5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗：
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4413
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414
  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)、含 DAPI 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：应当直接在多孔板上、腔式载玻片中或盖玻片上进行细胞培育、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意：甲醛有毒，仅在通风柜中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

发布​时间 2016 年 9 月

实验步骤编号：1204

特异性/灵敏度

TIGIT (E5Y1W) XP® Rabbit mAb 可检测 TIGIT 总蛋白的内源水平。

物种反应性：

人

来源/纯化

使用人 TIGIT 蛋白羧基末端特异性重组蛋白对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。该抗体会与某些细胞提取物中 42 kDa 的未知蛋白发生交叉反应。

背景

含 Ig 及 ITIM 结构域的 T 细胞免疫受体 (TIGIT)（又称 VSIG9、VSTM3 和 WUCAM）是免疫球蛋白脊髓灰质炎病毒受体家族的一员 (1-3)。TIGIT 在 T 细胞和自然杀伤 (NK) 细胞亚群上的表达水平很低，但在这些细胞激活后蛋白水平会上调 (1-4)。在肿瘤微环境中 (5) 以及在人免疫缺陷病毒 (HIV) 感染期间 (6)，TIGIT 标志着 T 细胞耗竭。研究表明，TIGIT 会与多种在抗原呈递细胞上表达的受体发生相互作用，例如树突细胞和巨噬细胞，以及肿瘤细胞和微环境中的细胞。TIGIT 会高亲和力地结合 PVR/CD155，但却低亲和力地结合 Nectin-2/CD112 和 Nectin-3/CD113 (2,4,7)。一旦与其配体结合，TIGIT 会抑制 T 细胞激活，并抑制 T 和自然杀伤细胞的细胞毒性。使用定向 TIGIT 的细胞外结构域的单克隆抗体时，可阻止这种抑制，这会导致在肿瘤中和 HIV 感染期间抗原特异性 CD8+ T 细胞反应出现更新 (5,6,8)。TIGIT 的三种潜在同工型通过计算方式绘制成图 (9)。

有限使用

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