Tox Antibody #99036

蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹，在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween^® 20 中稀释的一抗孵育过夜，同时柔和振摇。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测，进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH₂O，混合。
2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH₂O ，混合。
3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH₂O 稀释至 1X。
4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH₂O ，混合。
5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH₂O 中，并混合。
6. 含有 Tween^® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH₂O 中并混合。
7. 脱脂奶粉：(#9999)。
8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
6. 微量离心机内离心 5 分钟。

7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

   注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

用于蛋白免疫印迹分析的免疫沉淀法

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法，进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

A. 溶液与试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808)。

2. 10X 细胞裂解缓冲液： (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5)，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA，1% Triton X-100，2.5 mM 焦磷酸钠，1 mM β 甘油磷酸酯，1 mM Na₃VO₄，1 μg/ml 亮抑酶肽

   注意： CST 建议在使用前应添加 1 mM PMSF (#8553)*。

3. 3X SDS 样品缓冲液： (#7722) 187.5 mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C），6% w/v SDS，30% 甘油，150 mM DTT，0.03% w/v 溴酚蓝
4. 6-Tube Magnetic Separation Rack：(#7017)。
5. 10X 激酶缓冲液（用于激酶试验）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH₂O 中并混合。
6. ATP (10 mM)（用于激酶试验）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从板上刮下细胞，并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎，每次 5秒。
6. 在 4°C，14,000 x g 条件下，离心 10 分钟，将上清转移到新管中。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

1. 取 200 μl 细胞裂解物并添加 10 µl 固定化抗体，在 4°C 转动孵育过夜。
2. 使用磁力架洗涤沉淀物并将微珠沉淀，待完全澄清后，废弃上清液，添加 500 µl 1X 细胞裂解缓冲液，涡旋混合以重悬及洗涤微珠，继续重复 4 次，共计洗涤 5 次。
3. 继续使用蛋白质印迹法或激酶活性分析对进行样品分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
3. 对于 SDS-PAGE，将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注意：当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）作为二抗，以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗，以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

1. 使用磁力架洗涤沉淀物并将微珠沉淀，待完全澄清后，废弃上清液，添加 500 µl 1X 激酶缓冲液，涡旋混合以重悬及洗涤微珠，继续重复 1 次，共计洗涤 2 次。洗涤间期，保持样品于冰上。
2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。