TRA-1-81 (TRA-1-81) Mouse mAb #4745

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 二甲苯。
2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。
3. 去离子水 (dH₂O)。
4. 苏木精（可选）。
5. 洗涤缓冲液：
   1. 含 Tween^® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween^® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH₂0 中并混合。
6. SignalStain^® Antibody Diluent (#8112)。
7. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH₂O 中。
8. 3% 过氧化氢：要制备 100 ml，添加 10 ml 30% H₂O₂ 至 90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备 4 mL of dH₂O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
10. 检测系统：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125)。
11. 底物：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)。
12. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
13. 封片剂： SignalStain^® Mounting Medium (#84583)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
6. 去除封闭液，并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain^® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
7. 让 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Mouse #8125) 平衡至室温。
8. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 按需在切片上滴 1–3 滴 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Mouse #8125)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain^® DAB Diluent 中，使用前充分混合。
12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain^® DAB，并密切观察，通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
13. 将切片浸入 dH₂O 中。
14. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
15. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
17. 使用盖玻片和封片剂 (#84583) 封片。

注意：使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗，考虑到检测试剂的不同灵敏度。

免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
3. 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 20X PBS、1.25 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（如 Normal Goat Serum (#5425)）和 9.0 mL dH₂O，然后充分混匀。
4. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA)：添加 0.1 g BSA (9998) 至 10 ml 1X PBS 中，然后充分混匀。

5. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗：

   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate)#4408
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate)#4409
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate)#8890
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate)#4410

   注意：首次使用一抗或荧光物质标记的二抗时，用滴定法检测抗体，以确定哪种稀释度会在最低的背景下为您的样品产生最强的特定信号。

6. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。注意：甲醛有毒性，仅可在通风橱中使用
2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
4. 4°C 温度下孵育过夜。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
6. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
7. 按步骤 5 使用 1X PBS 漂洗。
8. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong^® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
9. 为达到最佳效果，应立即采用适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

流式细胞术 Triton™ X-100 小鼠抗体通透实验步骤

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂均可与我公司的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Triton™ X-100) #51995 一并高效购买，或使用下文所列的货号单独购买。

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 1 X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：要配制 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水，混合。
2. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)
3. 细胞透化缓冲液：购买即用型 (#39487) ，或要配制 10 ml，请添加 30 µl Triton™ X-100 到 10 ml 抗体稀释液。4°C 保存。
4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释液 (#13616)，或要配制 100 ml，请在 100 ml 1X PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998)。4°C 保存。
5. 建议的抗小鼠二抗：
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab′)₂ Fragment (Alexa^® 488 Conjugate) #4408
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab′)₂ Fragment (Alexa^® 594 Conjugate) #8890
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab′)₂ Fragment (Alexa^® 647 Conjugate) #4410
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab′)₂ Fragment (PE Conjugate) #59997

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活力指示染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品网页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定与透化

注：固定前，贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

注：如果使用全血，则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

注：如果表位遭甲醛和/或 Triton™ X-100 破坏，则可在固定前添加靶向 CD 标志物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。如果您不确定，请进行小规模实验。

1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。
5. 在每一百万个细胞约 100 μl 细胞透化缓冲液中重悬细胞。
6. 在室温孵育 10 分钟。
7. 继续进行染色或将细胞在 PBS 中 -4°C 保存过夜。

C. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次检测用 5x10⁵ 至 1x10⁶ 个细胞）。
2. 将细胞离心，弃去清液。
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
4. 室温 (20-25°C) 孵育 1 小时。
5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
6. 在 100 µl 稀释的荧光素偶联的二抗（按建议的稀释比例用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
7. 在室温 (20-25°C) 下孵育 30 分钟。避光。
8. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
9. 在 1X PBS 中重悬细胞，在流式细胞分析仪上分析。

实验步骤编号：1345