Goat Anti-Mouse Kappa Light Chain, F(ab')₂ Antibody (Low Endotoxin, Azide-free) #75861

A. 溶液与试剂

1. Human CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #92511
2. Human CD28 Activating (CD28.2) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #91920
3. 仅用于可溶性刺激：Goat Anti-Mouse Kappa Light Chain, F(ab’)₂ Antibody (Low Endotoxin, Azide-free) #75861

B. 刺激实验步骤：可溶性

1. 通过离心分离采集目标细胞。
2. 抽吸上清液。
3. 使用冷无血清培养基，以 10⁶-10⁷ 个细胞/ml 重悬细胞。
4. 以 1:200 的比例把 CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #92511 添加到细胞中，以达到 10 µg/ml 的最终浓度。
5. 可选：以 1:200 的比例把 Human CD28 Activating (CD28.2) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #91920 添加到细胞中，以达到 10 µg/ml 的最终浓度。
6. 将带激动剂抗体的细胞置于冰上 30 分钟。
7. 通过离心收集细胞。
8. 抽吸上清液。
9. 使用无血清冷培养基，以 10⁶-10⁷ 个细胞/ml 重悬细胞，并置于冰上。
10. 如果仅使用 CD3ε (OKT3) ，则以 1:50 的比例把 Goat Anti-Mouse Kappa Light Chain, F(ab’)₂ Antibody (Low Endotoxin, Azide-free) #75861 二抗添加到细胞中，以达到 10 µg/ml 的最终浓度；如果同时使用 CD3ε (OKT3) 和 CD28 (CD28.2)，则以 1:25 的比例添加以达到 20 µg/ml 的最终浓度。
11. 将含二抗的细胞置于冰上 15 分钟。
12. 要启动刺激，将细胞转移到 37 °C 水浴维持刺激所需的时间。
13. 要终止刺激，请遵循为所需分析方法推荐的细胞制备实验步骤。

C. 刺激实验步骤：基于板子

1. 在无菌 10 PBS 中制备 µg/ml 的 CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) 92511# 溶液。准备足够的体积以覆盖孔底部，用于刺激 T 细胞（96 孔板大约为 50 µl，6 孔板为 1 ml）。
2. 将稀释的 CD3ε (OKT3) 抗体溶液添加到选择作为处理组的孔中。将等量的无菌 PBS 添加到选择作为处理对照的孔中。
3. 盖上反应板并在 37 °C 下孵育至少 2 小时。如果需要，可以让反应板温育过夜。
4. 根据需要制备细胞，以在足够体积的完整培养基中生成大约 1 x 10⁶ 细胞/ml 的细胞悬液（对于 96 孔板，每孔 100 µl；{ut6 } ml 用于 6 孔板）。最佳细胞密度可以使用待研究的细胞进行预实验来确定。对于 T 细胞扩增，向细胞悬液中加入 Human Interleukin-2 (hIL-2) #8907 以产生 20 ng/ml 的最终浓度。
5. 从孔中吸出 CD3ε (OKT3) 抗体溶液，并用多余的无菌 PBS 冲洗孔 2 次，以去除未结合的抗体。
6. 按步骤 4 中指定的体积或通过实验确定的体积，将细胞悬浮液添加到所有孔中。
7. 添加 Human CD28 Activating (CD28.2) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #91920 以产生 2 µg/ml 的最终浓度。如果需要，在完全培养基中预稀释 CD28 (CD28.2) 抗体。如果需要，也可以将 CD28 抗体添加到部分对照孔中。
8. 在加湿培养箱中培养细胞所需的时间（37 °C，5% CO₂）。根据需要添加含有 IL-2 的新鲜培养基以进行 T 细胞扩增。
9. 收集细胞，然后根据需要进行免疫染色或分析。