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8095
Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) (Magnetic Bead Conjugate)
WB 试剂与 IP 试剂
单克隆抗体
R
重组

Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) (Magnetic Bead Conjugate) #8095

引用 (9)
筛选器:
  1. IP
使用 Mouse IgG (Magnetic Bead Conjugate) #5873(泳道 1 和 2)或 Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) (Magnetic Bead Conjugate)(泳道 3 和 4),对未经或已经过钒酸钠处理的 Jurkat 细胞提取物进行免疫沉淀。使用 Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) (HRP Conjugate) #5465 检测蛋白质印迹。
To Purchase # 8095S
目录# 规格 价格 库存
8095S
400 µl

支持性数据

反应性 All
灵敏度 内源性
MW (kDa)
来源/同种型 小鼠 IgG1

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology (CST) 的这种抗体通过肼基烟酰胺修饰抗体与甲酰苯甲酰胺修饰磁珠之间的共价反应进行固定。Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) (Magnetic Bead Conjugate) 用于进行免疫沉淀检测。未标记的 Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) #9411 会与所有物种的磷酸化酪氨酸蛋白发生反应。CST 预计 Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) (Magnetic Bead Conjugate) 还可识别所有物种中的磷酸化蛋白。

产品使用信息

应用 稀释度
免疫沉淀法 1:20

保存

保存在 PBS 缓冲液(pH 为 7.2)、0.1% Tween® 20 中。4°C 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

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用于蛋白免疫印迹分析的免疫沉淀法

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法,进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

A. 溶液与试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808)。
  2. 10X 细胞裂解缓冲液: (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5),150 mM NaCl,1 mM EDTA,1 mM EGTA,1% Triton X-100,2.5 mM 焦磷酸钠,1 mM β 甘油磷酸酯,1 mM Na3VO4,1 μg/ml 亮抑酶肽

    注意: CST 建议在使用前应添加 1 mM PMSF (#8553)*。

  1. 3X SDS 样品缓冲液: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl(pH 6.8,25°C),6% w/v SDS,30% 甘油,150 mM DTT,0.03% w/v 溴酚蓝
  2. 6-Tube Magnetic Separation Rack:(#7017)。
  3. 10X 激酶缓冲液(用于激酶试验):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  4. ATP (10 mM)(用于激酶试验):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎,每次 5秒。
  6. 在 4°C,14,000 x g 条件下,离心 10 分钟,将上清转移到新管中。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

  1. 取 200 μl 细胞裂解物并添加 10 µl 固定化抗体,在 4°C 转动孵育过夜
  2. 使用磁力架洗涤沉淀物并将微珠沉淀,待完全澄清后,废弃上清液,添加 500 µl 1X 细胞裂解缓冲液,涡旋混合以重悬及洗涤微珠,继续重复 4 次,共计洗涤 5 次。
  3. 继续使用蛋白质印迹法或激酶活性分析对进行样品分析(D 部分)。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE,将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

注意:当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)作为二抗,以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127),以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗,以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

  1. 使用磁力架洗涤沉淀物并将微珠沉淀,待完全澄清后,废弃上清液,添加 500 µl 1X 激酶缓冲液,涡旋混合以重悬及洗涤微珠,继续重复 1 次,共计洗涤 2 次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​时间 2007 年 12 月

修订时间 2021 年 10 月

实验步骤编号:408

特异性/灵敏度

Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) (Magnetic Bead Conjugate) 包含高亲和力微珠。对各种磷酸肽进行的 ELISA 表明,周围氨基酸序列对P-Tyr-100与磷酸-Tyr的结合没有很大程度的影响。对经过矾酸钠处理的细胞提取物进行的 2D 凝胶蛋白质印迹分析表明,P-Tyr-100 会与各种酪氨酸磷酸化蛋白相互作用。P-Tyr-100 不会与包含磷酸-Ser 或磷酸-Thr 的肽发生交叉反应。(美国专利编号:6,441,140;6,982,318;7,259,022;7,344,714;美国标准编号 11,484,485;以及所有外国对等物。)

物种反应性:

预期的所有物种

来源/纯化

使用包含磷酸化酪氨酸的肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

酪氨酸磷酸化在细胞信号转导中发挥关键作用 (1)。研究表明,在癌细胞中,未调节的酪氨酸激酶活性可通过产生不正常的增殖和存活信号来促成恶性疾病和肿瘤的形成 (2)。在这些研究中,对磷酸酪氨酸 (3,4) 有特异性的抗体被证明是有价值的试剂。Cell Signaling Technology 开发的磷酸酪氨酸单克隆抗体提供极其敏感的工具,以在高通量药物发现中研究酪氨酸磷酸化并监视酪氨酸激酶活性。

有限使用

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