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5168
VEGF Receptor 2 (55B11) Rabbit mAb (Sepharose Bead® Conjugate)
WB 试剂与 IP 试剂
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VEGF Receptor 2 (55B11) Rabbit mAb (Sepharose Bead® Conjugate) #5168

引用 (5)
筛选器：
  1. IP
使用 VEGF Receptor 2 (55B11) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) 和 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Sepharose® Bead Conjugate) #3423 ，对 PAEC/CKR 细胞裂解物进行免疫沉淀。使用 VEGF Receptor 2 (55B11) Rabbit mAb #2479 检测蛋白质印迹。PAEC/CKR 细胞过表达包含人 CSF-1 胞外结合域/小鼠 VEGF 受体 2 胞内域的嵌合受体 (7)。
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5168S		 400 µl

Custom Formulation

支持性数据

反应性 H M
灵敏度 内源性
MW (kDa) 210, 230
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体通过其伯胺基团，与经N-羟基丁二酰亚胺 (NHS) 激活的 Sepharose® 糖珠共价结合VEGF Receptor 2 (55B11) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) 用于进行免疫沉淀检测。该抗体的物种交叉反应性预计与非偶联 VEGF Receptor 2 (55B11) Rabbit mAb #2479 相同。
MW (kDa) 210, 230

产品使用信息

应用 稀释度
免疫沉淀法 1:20

保存

存储在 10 mM HEPES 钠 (pH 为 7.5 )，150 mM NaCl、100 µg/ml BSA，50 % 甘油中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

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用于蛋白免疫印迹分析的免疫沉淀法

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法，进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

A. 溶液与试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808)。

  2. 10X 细胞裂解缓冲液： (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5)，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA，1% Triton X-100，2.5 mM 焦磷酸钠，1 mM β 甘油磷酸酯，1 mM Na3VO4，1 μg/ml 亮抑酶肽

    注意： CST 建议在使用前应添加 1 mM PMSF (#8553)*。

  1. 3X SDS 样品缓冲液： (#7722) 187.5 mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C），6% w/v SDS，30% 甘油，150 mM DTT，0.03% w/v 溴酚蓝
  2. 10X 激酶缓冲液（用于激酶试验）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  3. ATP (10 mM)（用于激酶试验）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞，并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎，每次 5秒。
  6. 在 4°C，14,000 x g 条件下，离心 10 分钟，将上清转移到新管中。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

  1. 取出​200 μl 细胞裂解液，然后添加10 μl 的 固定抗体，并在4°C旋转孵育过夜。
  2. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，同时洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
  3. 继续使用蛋白质印迹法或激酶活性分析对进行样品分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE，将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注意：当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）作为二抗，以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗，以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​时间 2007 年 12 月

修订时间 2021 年 10 月

实验步骤编号：27

特异性/灵敏度

VEGF Receptor 2 (55B11) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) 可检测内源水平的 VEGF 受体 2 蛋白。该抗体不与其他家族成员发生交叉反应。

物种反应性：

人, 小鼠

Species predicted to react based on 100% sequence homology

牛

来源/纯化

使用包含人 VEGF 受体 2 蛋白的羧基末端 150 氨基酸残基的重组蛋白，对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

血管内皮生长因子受体 2 (VEGFR2, KDR, Flk-1) 是内皮细胞中 VEGF 诱导的信号转导的主要受体。结合配体时，VEGFR2 自磷酸化并被激活 (1)。VEGFR2 的主要自磷酸化位点位于激酶插入结构域 (Tyr951/996) 和酪氨酸激酶催化结构域 (Tyr1054/1059) (2)。受体激活会导致接头蛋白快速募集，包括 Shc、GRB2、PI3 激酶、NCK 以及蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP-1 和 SHP-2 (3)。Tyr1212 磷酸化为 GRB2 结合提供一个结合位点，并且磷酸 Tyr1175 能结合 PI3 激酶和 PLCγ 的 p85 亚基以及 Shb (1,4,5)。VEGFR2 信号转导对于实现 VEGF 刺激引起的增殖、趋化和发芽以及体外培养内皮细胞的存活和体内血管生成非常重要 (6-8)。

通路

探索与本品相关的通路。

有限使用

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