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11882
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)
抗体偶联物
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R
重组

Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #11882

引用 (74)
筛选器：
  1. IHC
  2. IF
  3. F
Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded 4T1 syngeneic tumor using Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) (green) and DAPI #4083 (blue).
使用 Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)（绿色）对正常大鼠结肠细胞进行共聚焦免疫荧光分析。使用 DY-554 phalloidin（红色）标记肌动蛋白纤丝。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。
使用 Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)（绿色）对 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。使用 DY-554 phalloidin（红色）标记肌动蛋白纤丝。
使用 Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) 和 Propidium Iodide (PI) /RNase Staining Solution #4087 ，对 Jurkat 细胞进行流式细胞分析（DNA 含量）。
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11882S		 100 µl （50 次检测）

Bulk & Custom Formulation

支持性数据

反应性 H M R
灵敏度 内源性
MW (kDa)
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体与 Alexa Fluor® 488 荧光染料接合。该抗体显示的物种交叉反应性预计与非偶联的 Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb #9129 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
免疫组织化学（石蜡） 1:100 - 1:400
免疫荧光法（冰冻） 1:100 - 1:200
免疫荧光法（免疫细胞化学） 1:100 - 1:200
流式细胞术（固定/通透） 1:50

保存

保存在 PBS（pH 为 7.2）、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。4°C 保存。切勿分装抗体。避光。切勿冷冻。

实验步骤

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免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 洗涤缓冲液：
    1. 含 Tween®20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液 (TBST)：要配制 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween®20 (TBST)(#9997) 的 10 X Tris 盐缓冲液至 900 ml dH20 中，混合。
    2. 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要配制 1L 1X PBS，添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH20 中，混合。
  5. SignalStain® Antibody Diluent: (#8112)
  6. 1X EDTA 修复液：要配制 250 mL 1X EDTA 修复液，用 225 ml dH2O 稀释 25 ml SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747)。
  7. 3% 过氧化氢：要制备，添加10 ml 30% H2O2至90 ml dH2O 中。
  8. 封闭液：1X TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备4 mL 的 dH2O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  9. Prolong® Gold AntiFade Reagent(#9071)、Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI(#8961)。
  10. （可选）TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher (#92401)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤：
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

  1. 在微波炉中加热浸于 1X EDTA 修复液的切片直至开始沸腾为止；继而在亚沸腾温度 (95°-98°) 持续 15 分钟。无需冷却。

    2. D. 染色

    1. 用 dH2O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
    2. 在 1X TBST 中孵育切片 5 分钟。
    3. 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液，在室温下封闭 1 小时。
    4. 移除封闭液，并向每张切片添加稀释于 SignalStain® Antibody Diluent 中的 100-400 µl 一抗。
    5. 在 4°C 过夜孵育。
    6. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。
      注：请参阅下文，了解可选的 TrueBlack® 脂褐素自发荧光淬灭剂实验步骤。
    7. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI，用盖玻片盖住切片。
    8. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。为长期储存，将切片在 4°C 避光平放储存。

    TrueBlack® 脂褐素自发荧光猝灭剂实验步骤

    按照 D 部分步骤 6：

    重要提示：TrueBlack® 脂褐素自发荧光猝灭剂与去垢剂不兼容。任何涉及去垢剂的步骤必须在施加 TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher 之前完成。

    1. 通过在 70% 乙醇中 1:20 稀释来配制 TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher 溶液。涡旋混合。注：猝灭液应在用前新鲜配制，且若沉淀物可见则丢弃。我们建议在稀释前将装有 TrueBlack® 脂褐素自发荧光猝灭剂的 20X DMF 原液加热至 70°，以免形成沉淀物。
    2. 立即用 100 µL - 200 µL 猝灭溶液在室温覆盖组织切片 30 秒。重要提示：请勿让切片干透。切片可以耐受更长的孵育（长达 3 分钟），只要它们保持水化即可。
    3. 在转移到 1X PBS 之前，在吸水毛巾上轻拍切片以归集多余 TrueBlack® 脂褐素自发荧光猝灭剂。
    4. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
    5. 继续进行复染/封片。

实验步骤编号：2924

免疫荧光法（冰冻）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton™ X-100)：要配制 10 ml：添加 0.5 ml normal goat serum 和 0.5 ml 20X PBS 到 9.0 ml dH2O 中，混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液： (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。
  5. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 样品制备 - 冰冻/恒冷箱切片 (IF-F)

  1. 冰冻固定组织进行免疫染色（C 部分）。
  2. 对新鲜未固定的冰冻组织，请立刻按下列步骤固定：

    1. 切片用 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛浸没。

      注意：甲醛有毒性，仅可在通风橱中使用。

    2. 室温下固定切片 15 分钟。
    3. 吸干液体后用 1X PBS 冲洗三次，每次 5 分钟。
    4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时，按照产品网页实验步骤中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
  7. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

发布​时间 2006 年 11 月

修订时间 2013 年 11 月

实验步骤编号：222

免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton™ X-100)：要配制 10 ml：添加 0.5 ml normal goat serum 和 0.5 ml 20X PBS 到 9.0 ml dH2O 中，混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液： (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。
  5. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意：甲醛有毒性，需在通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
  7. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

发布​时间 2006 年 11 月

修订时间 2013 年 11 月

实验步骤编号：182

流式细胞术，无 BSA 的甲醇透化实验步骤

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：若要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水，混合。
  2. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604)：使用前冷却。

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活力指示染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品网页，了解建议的实验步骤。

B. 固定

注：固定前，贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

注：如果使用全血，则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

注：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白质的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。继续进行透化步骤。
    1. 或者，细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

  1. 通过温和涡旋混合的同时，向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度，使细胞透化。
    1. 如果容器体积有限（例如，96 孔板中），则通过与适当体积的 1X PBS 混合生成 90% 甲醇溶液。使细胞沉淀并丢弃上清液，然后添加 100 μl 90% 甲醇至细胞。确保细胞沉淀物充分解离。
  2. 在冰上透化最短 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色（D 部分）或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离，以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
  2. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次分析 5x105 至 1x106 个细胞。）
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，该一抗在 1X PBS 中按建议或如滴定测定所确定的稀释度配制。
  4. 室温孵育 1 小时。避光。
  5. 用 1X PBS 进行离心分离来洗涤。弃去上清液。重复。如果使用直接偶联抗体，则跳到步骤 9。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联二抗中重悬细胞，该二抗在 1X PBS 中按建议或如滴定测定所确定的稀释度配制。
  7. 室温孵育 30 分钟。
  8. 用 1X PBS 进行离心分离来洗涤。弃去上清液。重复。
  9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2023 年 6 月

实验步骤编号：2985

特异性/灵敏度

Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) recognizes endogenous levels of total Ki-67 protein by Flow Cytometry. It lacks sensitivity in low-expressing cells by immunofluorescence but may be used to detect moderate-to-high levels of Ki-67 in cultured cells and frozen tissues. IHC-P 的物种反应性仅限于小鼠。

物种反应性：

人, 小鼠, 大鼠

来源/纯化

使用对人 Ki-67 蛋白的氨基末端具有特异性的重组蛋白，对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Ki-67，以其中发现它的地点（基尔大学，德国）命名，是在正在增殖的细胞中普遍表达并且在静息细胞中不存在的非组蛋白核蛋白 (1) (2)。Ki-67 可检测在 G1 期、S 期、G2 期和有丝分裂期、但不在 G0 静息期的正在增殖的细胞。研究已经证实，高水平 Ki-67 与更差的乳腺癌生存相关 (3)。研究已经探索了 Ki-67 连同其他标志物一起作为乳腺癌和其他恶性疾病中潜在的预后或预测标志物的用途 (4)。

有限使用

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