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4528
Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)
抗体偶联物
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R
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Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4528

引用 (8)
筛选器：
  1. IHC
  2. IF
  3. F
使用 Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)（红色）和 DAPI #4083（蓝色）对石蜡包埋的人宫颈鳞状细胞癌组织进行免疫组织化学分析。
Confocal immunofluorescent analysis of methanol fixed frozen mouse liver labeled with Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) (left, red) and co-labeled with Vimentin (D21H3) XP® Rabbit mAb #5741 (right, green) and ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI #8961 (right, blue).
Confocal immunofluorescent analysis of methanol fixed frozen mouse skin labeled with Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) (left, red) and co-labeled with Vimentin (D21H3) XP® Rabbit mAb #5741 (right, green) and ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI #8961 (right, blue).
使用 Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)（蓝色伪彩）和 Histone H3 Antibody #9715（绿色），对 MCF-7 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。
使用 Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 对 Jurkat（蓝色）和 MCF-7（绿色）细胞进行流式细胞分析。
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4528S		 100 µl （50 次检测）

Bulk & Custom Formulation

支持性数据

反应性 H M R Mk
灵敏度 内源性
MW (kDa)
来源/同种型 小鼠 IgG1

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology® 的这种抗体在最合适的条件下与 Alexa Fluor® 647 荧光染料偶联。This antibody conjugate is expected to exhibit the same species cross-reactivity as the unconjugated Pan-Keratin (C11) Mouse mAb #4545.

产品使用信息

应用 稀释度
免疫组织化学（石蜡） 1:50 - 1:200
免疫荧光法（冰冻） 1:100 - 1:400
免疫荧光法（免疫细胞化学） 1:800 - 1:3200
流式细胞术（固定/通透） 1:800

保存

保存在 PBS（pH 为 7.2）、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。4°C 保存。切勿分装抗体。避光。切勿冷冻。

实验步骤

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免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 洗涤缓冲液：
    1. 含 Tween®20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液 (TBST)：要配制 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween®20 (TBST)(#9997) 的 10 X Tris 盐缓冲液至 900 ml dH20 中，混合。
    2. 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要配制 1L 1X PBS，添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH20 中，混合。
  5. SignalStain® Antibody Diluent: (#8112)
  6. 1X EDTA 修复液：要配制 250 mL 1X EDTA 修复液，用 225 ml dH2O 稀释 25 ml SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747)。
  7. 3% 过氧化氢：要制备，添加10 ml 30% H2O2至90 ml dH2O 中。
  8. 封闭液：1X TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备4 mL 的 dH2O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  9. Prolong® Gold AntiFade Reagent(#9071)、Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI(#8961)。
  10. （可选）TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher (#92401)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤：
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

  1. 在微波炉中加热浸于 1X EDTA 修复液的切片直至开始沸腾为止；继而在亚沸腾温度 (95°-98°) 持续 15 分钟。无需冷却。

    2. D. 染色

    1. 用 dH2O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
    2. 在 1X TBST 中孵育切片 5 分钟。
    3. 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液，在室温下封闭 1 小时。
    4. 移除封闭液，并向每张切片添加稀释于 SignalStain® Antibody Diluent 中的 100-400 µl 一抗。
    5. 在 4°C 过夜孵育。
    6. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。
      注：请参阅下文，了解可选的 TrueBlack® 脂褐素自发荧光淬灭剂实验步骤。
    7. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI，用盖玻片盖住切片。
    8. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。为长期储存，将切片在 4°C 避光平放储存。

    TrueBlack® 脂褐素自发荧光猝灭剂实验步骤

    按照 D 部分步骤 6：

    重要提示：TrueBlack® 脂褐素自发荧光猝灭剂与去垢剂不兼容。任何涉及去垢剂的步骤必须在施加 TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher 之前完成。

    1. 通过在 70% 乙醇中 1:20 稀释来配制 TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher 溶液。涡旋混合。注：猝灭液应在用前新鲜配制，且若沉淀物可见则丢弃。我们建议在稀释前将装有 TrueBlack® 脂褐素自发荧光猝灭剂的 20X DMF 原液加热至 70°，以免形成沉淀物。
    2. 立即用 100 µL - 200 µL 猝灭溶液在室温覆盖组织切片 30 秒。重要提示：请勿让切片干透。切片可以耐受更长的孵育（长达 3 分钟），只要它们保持水化即可。
    3. 在转移到 1X PBS 之前，在吸水毛巾上轻拍切片以归集多余 TrueBlack® 脂褐素自发荧光猝灭剂。
    4. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
    5. 继续进行复染/封片。

实验步骤编号：2924

甲醇固定（偶联物）的免疫荧光实验步骤

A. 溶液与试剂

若想获得高质量的免疫荧光图片，请使用我们的 Immunofluorescence Application Solutions Kit (#12727) 中高效且划算的预制试剂。

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要配制 1 L 1X PBS，添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH2O 中，然后混匀。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醇 (#13604)：100%，使用冰镇。
  3. 封闭液：购买即用型免疫荧光封闭液 (#12411)，或通过添加与二抗同一物种来源的 0.5 mL 正常血清（例如，正常山羊血清 (#5425)）和 30 µL Triton ™ X-100 到 9.5 mL 1X PBS 中，来制备 1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100 缓冲液。4°C 保存。
  4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型免疫荧光抗体稀释缓冲液（#12378），或通过添加 0.1 g BSA（#9998）和 30 µl Triton™ X-100 至 10 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100 缓冲液。4°C 保存。

B. 固定

注：该抗体要求组织切片用 100% 的冰冷甲醇固定。在此步骤期间避免干燥。

  1. 对于未固定的冰冻组织切片 (IF-F)，请立即固定，如下所示：
    1. 用冰冷的 100% 甲醇覆盖切片至 2-3 mm 的深度。
    2. 让切片在冰上或在 -20°C 下固定 15 分钟。
    3. 用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。

C. 免疫染色

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时，在抗体稀释缓冲液中制备一抗（建议的稀释范围请参见产品网站）。
  3. 吸出封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。
  6. 适当的复染。

    注意：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括 DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。

  7. 安装样品进行成像。
  8. 为了长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。

实验步骤编号：2764

免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醇，100%
  3. 封闭液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton™ X-100)：要配制 10 ml：添加 0.5 ml normal goat serum 和 0.5 ml 20X PBS 到 9.0 ml dH2O 中，混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (9998)，并混合。
  5. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 冰冷的 100% 甲醇。
  2. 在 -20°C 温度下，可让细胞固定15分钟。
  3. 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 温度下孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
  7. 为达到最佳效果，应立即采用适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

发布​时间 2010 年 12 月

实验步骤编号：221

流式细胞术，针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买，或使用下文所列的货号单独购买。

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：若要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水，混合。
  2. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604)：用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活力指示染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品网页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定

注：固定前，贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

注：如果使用全血，则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

注：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白质的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。继续进行透化步骤。
    1. 或者，细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

  1. 通过温和涡旋混合的同时，向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度，使细胞透化。
  2. 在冰上透化最短 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色（D 部分）或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次测定 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。）
  2. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离，以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
  4. 室温孵育 1 小时。避光。
  5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2009 年 7 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：407

特异性/灵敏度

Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 可检测内源水平的总角蛋白 4、5、6、8、10、13 和 18 。该抗体不与其他角蛋白发生交叉反应。

物种反应性：

人, 小鼠, 大鼠, 猴

来源/纯化

使用 A-431 细胞的细胞骨架制备物对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。该抗体在最合适的条件下接合 Alexa Fluor® 647，其中 F/P 比值为 2-6。红光（如 633 nm 氦氖激光）可最大程度刺激 Alexa Fluor® 647 染料。Alexa Fluor® 647染料的抗体接合物会产生明亮的远红外荧光发射，峰值为 665 nm。

背景

角蛋白（细胞角蛋白）是主要在上皮细胞中表达的中间丝蛋白。Keratin heterodimers composed of an acidic keratin (or type I keratin, keratins K9-K28) and a basic keratin (or type II keratin, keratins K1-K8 and K71-K80) assemble to form filaments. Keratin isoforms demonstrate tissue- and differentiation-specific profiles that make them useful as research and clinical biomarkers (1,2).

Dysregulation/mutations in keratin genes can lead to a variety of disorders affecting the skin, hair, nails, and other epithelial tissues (3). While expression of keratins can be variable, immunohistochemical staining of keratins is widely used to help in the identification and classification of epithelial tumors, and may also provide prognostic information.

Keratins 8 and 18 (K8/K18) are expressed in simple epithelia of normal tissue, as well as in adenocarcinomas of the breast, lung, ovary, and gastrointestinal tract. Keratin 17 is expressed in basal keratinocytes of stratified epithelia, hair follicles, and sebaceous glands. Onset of keratin 17 expression coincides with the definition of major epithelial lineages during skin development (4). Keratin 14 (K14) is expressed in basal cells of stratified epithelia, and in basal-like subtypes of breast cancer and squamous cell carcinomas. Keratin 19 (K19) is expressed in glandular epithelia, including the liver, gallbladder, and pancreas, as well as in adenocarcinomas of the breast, thyroid, and bile duct. Keratin 20 (K20) is expressed in gastrointestinal epithelium, urothelium, and Merkel cells in the skin, as well as in colorectal carcinomas and some urothelial carcinomas. Keratin 5/6 (K5/6) is expressed in basal cells of stratified epithelia, including the skin, prostate, and breast, as well as in basal-like breast cancers, squamous cell carcinomas, and some lung carcinomas. Keratin 7 (K7) is expressed in glandular epithelia, such as those in the lung, breast, and female reproductive tract, as well as in adenocarcinomas of the lung, breast, and ovary (5,6).

Keratins, particularly K8, K18, and K19, serve as biomarkers for identification of circulating tumor cells (CTCs) (5).

Post-translational modifications, including phosphorylation, acetylation, ubiquitylation, sumoylation, glycosylation, and transamidation, have been shown to affect the functions of keratins in normal and disease states (6). Understanding the molecular mechanisms underlying these PTMs may provide insights into cancer pathogenesis.

有限使用

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